E-選擇素在大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷組織的動態表達及其意義

盛閩 王鋒 黃鶴光 陳志耀

·論著·

E-選擇素在大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷組織的動態表達及其意義

盛閩 王鋒 黃鶴光 陳志耀

目的探討E-選擇素在實驗性急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織的表達及其意義。方法按隨機數字法將大鼠分為對照組及ANP組。采用逆行膽胰管注射5%牛磺膽酸鈉制作大鼠ANP模型，術后3、6、12、24 h分批處死動物。檢測血清淀粉酶、白蛋白及Ca2+水平，計算肺濕/干重比，常規行胰腺和肺組織病理檢查并評分，實時熒光定量PCR及免疫組化法檢測大鼠肺組織E-選擇素mRNA和蛋白表達。結果ANP 6 h組大鼠血淀粉酶、胰腺及肺病理評分、肺濕/干重比分別為(3978±476)U/L、(8.22±0.63)分、(12.31±1.58)分、5.21±0.20，均顯著高于對照組的(843±90)U/L、(0.22±0.36)分、(0.13±0.34)分、4.46±0.17(P<0.05或<0.01)；血清白蛋白水平為(12.9±1.0)g/L，顯著低于對照組的(15.6±0.7)g/L(P<0.01)；12 h時的血Ca2+水平為(2.33±0.15)mmoL/L，顯著低于對照組的(2.57±0.23)mmoL/L(P<0.01)。E-選擇素定位于血管內皮細胞胞膜及胞質。ANP 6 h組大鼠肺組織E-選擇素mRNA與蛋白表達顯著高于對照組(3.51±0.45比0.95±0.16；0.174±0.019比0.060±0.006，P值均<0.01)。結論ANP大鼠并發肺損傷時肺組織的血管內皮細胞E-選擇素表達呈時間依賴性上調，并參與白細胞的附壁及外滲，促進肺損傷。

胰腺炎，急性壞死性； 肺損傷； E-選擇素； 模型，動物

重癥急性胰腺炎(SAP)早期易誘發全身炎癥反應綜合征(SIRS)，導致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，進而發展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。E-選擇素是內皮細胞特有的選擇素，是誘導性黏附分子[1]，幾乎僅表達在活化的內皮細胞上，在肺臟尤為明顯。正常情況下內皮細胞僅少量表達E-選擇素，在TNF-α、IL-1β及脂多糖等刺激后表達顯著增加。本研究檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)并發ALI大鼠E-選擇素的表達，評估E-選擇素在ANP肺損傷中的作用。

材料與方法

一、實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠64只，體重200～250 g，由上海斯萊克動物中心提供，動物質量許可證號SCXK(滬)2007-0005。實驗過程中對動物處置符合2006年科技部關于善待實驗動物的規定[2]。

按照隨機數字法將SD大鼠分為對照組和ANP組，每組32只。采用膽胰管逆行注射5%脫氧牛磺膽酸鈉溶液1 ml/kg體重的方法制備ANP模型，對照組僅將胰腺翻動按摩后即關腹。術后3、6、12、24 h分批處死大鼠。心尖采血，離心分離血清。用預冷PBS由心尖入路快速灌注沖洗，去除肺組織血管床中殘留血液，切取右下肺置-80°C冰箱保存，取右上肺及部分胰腺，甲醛固定，取左肺測濕、干重。

二、方法

1．血清淀粉酶、白蛋白及Ca2+水平檢測：采用全自動生化分析儀(LX20，Beckman)測定。

2．肺濕/干重比(W/D)：吸干左肺表面水分，稱濕重，然后將標本置于70℃烤箱烤72 h至恒重，稱干重，計算W/D。

3．胰腺及肺組織病理學檢查：常規行病理學檢查，并參照Schmidt等[3]標準和Thome等[4]標準分別對胰腺及肺損傷評分。

4．E-選擇素檢測：采用免疫組化法檢測E-選擇素的表達，試劑盒購自武漢博士德公司，按說明書操作。兔抗大鼠E-選擇素多抗(美國abCAM)工作濃度1∶100，生物素化羊抗兔IgG工作濃度1∶1000。以PBS代替一抗作為陰性對照。內皮細胞胞質中出現棕黃色顆粒為陽性。在400倍光鏡下隨機選取5個視野，用image-Pro Plus6.0圖像分析系統行圖像掃描，以平均光密度值表示蛋白表達強度。

5．肺組織E-選擇素mRNA 檢測：按50～100 mg組織加入1 ml Trizol提取RNA。采用熒光定量PCR法檢測E-選擇素mRNA 表達。E-選擇素引物上游5′-CTGCGATGCTGCCTACTTG-3′，下游5′-CCTGATTGCTCGCATCTTAGA-3′，產物231 bp；內參GAPDH引物上游5′-AAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′，下游5′-CCAGTAGACTCCACGACATACTCA-3′，產物137 bp。逆轉錄反應：30℃ 10 min，42℃ 60 min，75℃ 15 min；PCR反應： 95℃ 2 min，95℃ 10 s、60℃ 40 s，45次循環。通過PCR儀自帶軟件獲取△Ct值。mRNA表達量以2-△△Ct計算。以對照組為1，計算ANP組的表達倍數。

三、統計學處理

結 果

一、大鼠一般情況及胰腺、肺大體病理改變

ANP組大鼠術后逐漸出現氣促加劇、煩躁不安或靜默不動、厭食、呼吸困難等表現，瀕臨死亡前體溫下降，口鼻有淡紅色異常分泌物。處死后見腹腔內有渾濁血性腹水，胰腺充血水腫、出現黃色膠凍樣凝固壞死和皂化斑形成；大網膜、腸系膜等處廣泛粘連，腸管淤腫、擴張；肝臟表面見散在出血灶及黃白色壞死灶；肺臟表面有不同程度充血水腫，呈點狀至片狀出血斑，伴發3.5～5.5 ml胸水，24 h呈彌漫性出血(圖1)。對照組大鼠無明顯異常。

二、胰腺、肺組織病理改變

對照組大鼠胰腺組織結構基本完整清晰，腺泡細胞排列有序。ANP組大鼠胰腺水腫出血、炎癥細胞浸潤，腺細胞壞死，腺體結構消失，腺葉間隙增寬(圖1)。對照組大鼠肺組織未見明顯病理變化，ANP組大鼠3 h時見肺內毛細血管充血，間質水腫，少量炎癥細胞浸潤及紅細胞滲出；6 h時病變加重，肺泡腔內見少量淡紅色滲液，白細胞附著內皮細胞表面，內皮細胞部分水腫；12 h時肺泡腔內滲液、出血擴大，肺泡間隔明顯增寬，炎癥細胞浸潤明顯增多，部分肺泡萎陷不張，部分肺泡代償擴張；24 h時肺組織內彌漫出血，肺泡結構紊亂，肺泡壁破裂，大量炎癥細胞浸潤，部分肺組織出現實變(圖2)。胰腺及肺組織病理評分見表1。

圖1ANP組24 h肺大體改變(a)和胰腺組織病理改變(b HE ×200)

圖2對照組(a)及ANP組6(b)、24 h(c)組肺組織病理改變(HE ×200)

三、血清淀粉酶、白蛋白、Ca2+水平及肺W/D變化

ANP組血清淀粉酶呈階梯狀上升，于12 h達峰值，明顯高于對照組水平(P<0.01)；血清白蛋白在6 h后較對照組明顯下降(P<0.01)；Ca2+水平在12 h后明顯下降(P<0.05)；肺W/D比在6 h后顯著升高(P<0.01，表1)。

四、肺組織E-選擇素 mRNA及蛋白表達的變化

對照組大鼠肺組織E-選擇素 mRNA少量表達，ANP組E-選擇素mRNA表達在3 h即明顯升高，6 h達峰值，以后逐漸下降，但均高于對照組(P值均<0.01)。對照組肺組織血管內皮細胞僅見少量E-選擇素蛋白陽性細胞，ANP組大鼠肺組織血管內皮細胞強陽性表達E-選擇素，以6、12 h表達最強，顯著高于對照組水平(P值均<0.01，表1，圖3)。

圖3對照組(a)及ANP6(b)、24 h(c)組E-選擇素表達(免疫組化 ×400)

討 論

E-選擇素表達于炎癥部位的內皮細胞，它的胞膜外區由1個C型凝集素樣結構域、1個表皮生長因子樣(EGF)結構域和6個補體調節蛋白樣結構域(CCP)組成，通過其C型凝集素結構域同白細胞糖脂和糖蛋白上的唾液酸化路易糖(sLe)、唾液酸化的Lewis以及相關的巖藻糖基化的N-乙酰乳糖胺結合。E-選擇素主要介導白細胞在內皮細胞表面最初的附壁和滾動，以及隨后遷移到炎癥組織。外滲到損傷組織中的白細胞被激活后釋放炎癥因子、氧自由基及破壞性的酶類物質等，損傷肺組織結構，導致ALI發生、發展[5-6]。一些有害的炎癥因子也可以通過E-選擇素介導進入到損傷組織中[7]，擴大損傷效應。Joucher等[8]報道，在離體小鼠肺細胞凋亡模型中，E-選擇素的高表達是細胞凋亡的重要條件，且與FasL有關，還與蛋白酪氨酸磷酸酶活性增高有關。Hidalgo等[9]報道，E-選擇素可使極化、激活的整合素αMβ2聚集在滾動的中性粒細胞前沿，進而捕獲血小板和紅細胞，導致急性血管閉塞，連同產生的氧化物引起血管損傷和肺組織急性損傷。

表1 各組大鼠檢測指標比較

注：與對照組同時點比較，aP<0.05，bP<0.01

本研究結果顯示，ANP大鼠肺組織E-選擇素mRNA及蛋白表達均顯著上調，肺組織小血管內皮早期出現白細胞的邊集、滲出，以及在肺泡或肺間質中聚集，進一步證實E-選擇素是白細胞與內皮細胞形成接觸的啟動因子，是誘導和擴大炎癥損傷的重要“角色”。因此，抑制E-選擇素表達對控制ANP及相關肺損傷發展具有重要作用。

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[2] 中華人民共和國科學技術部.關于善待實驗動物的指導性意見．2006-09-30．

[3] Schmidt J，Rattner DW，Lewandrowski K，et al．A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy．Ann Surg，1992，215：44-56．

[4] Thome UH, Schulze A, Schnabel R，et al．Partial liquid ventilation in severely surfactant-depleted, spontaneously breathing rabbits supported by proportional assist ventilation．Crit Care Med，2001，29：1175-1180．

[5] Chooklin S．Pathogenic aspects of pulmonary complications in acute pancreatitis patients．Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2009，8：186-192．

[6] 趙曉晏，周鋼，郭萍．內皮素受體拮抗劑BQ123對大鼠急性壞死性胰腺炎E-、P-選擇素表達的影響．胰腺病學，2006，6：157-160．

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[8] Joucher F，Mazmanian GM，Michele GF．Role of E-selectin in cell apoptosis induced by allogeneic blood perfusion in isolated mouse lung．Transplantation，2005，80：666-672．

[9] Hidalgo A，Chang J，Jang JE，et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury．Nat Med，2009，15：384-391．

DynamicexpressionandsignificanceofE-selectininratofacutenecrotizingpancreatitisinducedlunginjury

SHENGMin,WANGFeng,HUANGHe-guang,CHENZhi-yao.

DerpatmentofSurgery,UnionHospital,FujianmedicalUniversity,Fuzhou350000,China

HUANGHe-guang,Email：hhuang2@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression and significance of E-selectin in lung tissue of rat of acute necrotizing pancreatitis (ANP)-induced lung injury.MethodsRats were randomly divided into control and ANP groups. ANP model was induced by retrograde injection of sodium taurocholate into the biliary and pancreatic duct. The rats were sacrificed at 3, 6, 12 and 24 h. Serum amylase, albumin, Ca2+and lung wet/dry (W/D) weight ratio were determined, and pancreas and lung tissues underwent routine pathological examination and histopathological scores were evaluated. The expression of E-selectin mRNA and protein in lung tissue of rat was measured by real-time fluorescence quantitative RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsIn ANP group at 6h, the serum level of amylase, histopathological scores of pancreas and lung tissues, lung W/D weight ratio were (3978±476)U/L, 8.22±0.63,(12.31±1.58, 5.21±0.20, which were significantly higher than those in control group [(843±90)U/L, 0.22±0.36,0.13±0.34,4.46±0.17，P<0.05 or <0.01], the serum level of albumin was (12.9±1.0)g/L, which was significantly lower than that in control group [(15.6±0.7)g/L,P<0.01], the serum level of Ca2+at 12 h was (2.33±0.15)mmoL/L, which was significantly lower than that in control group [(2.57±0.23)mmoL/L,P<0.01]. E-selectin was located in the cell membrane and cytoplasm of vascular endothelial cells. Expression of E-selectin mRNA and protein in the lung tissue at 6h was significantly higher than those in control group (3.51±0.45vs0.95±0.16, 0.174±0.019vs0.060±.006,P<0.01).ConclusionsPulmonary expression of E-selectin of vascular endothelial cell is significantly up-regulated in a time dependant manner when ANP-induced ALI occurs; and it is involved in leukocyte mural and extravasation, and can promote lung injury.

Pancreatitis,acute necrotizing； Lung injury； E-selectin； Models,animal

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.012

國家自然科學基金(81070369)

350000 福建福州，福建醫科大學附屬協和醫院基本外科

黃鶴光，Email：hhuang2@yahoo.com.cn

2011-11-30)

(本文編輯：屠振興)