胰腺癌XAF1基因啟動子甲基化及其蛋白表達的相關性

趙永福 楊紅星 唐哲

胰腺癌XAF1基因啟動子甲基化及其蛋白表達的相關性

趙永福 楊紅星 唐哲

XIAP相關因子1(XIAP-associated factor 1,XAF1)是一個新發現可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，可以逆轉XIAP對細胞的保護作用。它在所有胚胎組織及成人正常組織中廣泛表達，但在許多腫瘤組織和腫瘤細胞株中低表達甚至不表達，是一種潛在的腫瘤抑制因子[1-3]。XAF1位點的雜合性缺失及XAF1啟動子區的CpG島甲基化可能是其表達被抑制的機制[4-6]。本研究檢測XAF1蛋白在胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中的表達及XAF1甲基化狀態，分析它們之間的相關性，探討其在胰腺癌發生、發展中的作用。

一、材料和方法

1．臨床資料：收集鄭州大學第一附屬醫院2008年1月至2011年1月間48例臨床資料齊備的手術切除的胰腺癌標本、26例胰腺良性病變標本(胰島素瘤20例，慢性胰腺炎6例)和15例正常胰腺標本(外傷切除胰腺6例，十二指腸腫物切除獲得的正常胰腺9例)，所有標本均經病理學證實。胰腺癌患者中男36例，女12例，年齡37～75歲，其中≤55歲者13例，>55歲者35例，中位年齡61歲，術前均未給予放療、化療；胰腺良性疾病患者中男 9例，女 17例；正常胰腺組中男9例，女6例。

2．XAF1基因啟動子甲基化狀態檢測：采用生工生物工程(上海)有限公司的UNIQ-10柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取組織DNA；采用EZ DNA Methylation-GoldTMKit(ZYMO公司)對DNA進行亞硫酸鹽修飾；采用GENMED基因甲基化特異性PCR擴增試劑盒(GENMED公司)進行擴增。XAF1引物參考文獻[7-8]，甲基化引物上游為5′-TTTGTAAGAAACGAAATTTAATCGA-3′，下游為5′-CCTACCCTTAAAACCCACGAT-3′，擴增片段228 bp。未甲基化引物上游為5′-TTTGTAAGAAATGAAATTTAATTGA-3′；下游為5′-CTCCTACCCTTAAAACCCACAAT-3′，擴增片段230 bp。甲基化循環參數：95℃ 9 min，95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環，72℃ 5 min。未甲基化循環參數：94℃ 9 min，94℃ 30 s、54℃ 45 s、72℃ 30 s，35個循環，72℃ 5 min。取PCR擴增產物，電泳分離，紫外燈下觀察并攝像。

3．XAF1蛋白檢測：采用免疫組化法。兔抗人XAF1多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ公司，SP9001試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。結果判斷：XAF1 蛋白主要位于胞核和胞質,亦表達于核膜，出現棕黃色顆粒為陽性染色。每例觀察5個高倍視野，根據腫瘤細胞染色程度及陽性細胞百分數進行評分。無陽性細胞為0分，陽性細胞<20%為1分，20%～75%為2分， >75%為3分；無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃或棕褐色為3分。兩分相乘，0～3分為陰性，4～9分為陽性。

4．統計學處理：采用SPSS17.0統計軟件進行分析。各組蛋白表達陽性率采用Fisher精確檢驗和χ2檢驗。相關性分析采用配對四格表的關聯性分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

二、結果

1．胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中的XAF1基因啟動子甲基化狀態：在胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1基因甲基化率分別為31.3%(15/48)、7.7%(2/26)和0(0/15),胰腺癌組織XAF1甲基化頻率較胰腺良性疾病及正常胰腺組織顯著增高 (χ2=5.289,P=0.021；χ2=6.152，P=0.013)，后兩組間的差異無統計學意義(χ2=1.213，P=0.27，圖1)。

M：DNA Marker；1：陰性對照；2、3：胰腺癌組織；4、5：正常胰腺組織；m：甲基化引物；u：未甲基化引物

圖1胰腺癌和正常胰腺組織中XAF1基因啟動子甲基化狀態

2．胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1蛋白的表達：胰腺癌、胰腺良性疾病及正常胰腺組織中XAF1蛋白表達陽性率分別為52.1%(25/48)、84.6%(22/26)、88.9%(16/18)，癌組織XAF1表達率顯著低于胰腺良性疾病及正常胰腺組織(χ2值為25.98、23.57，P值均<0.05，圖2)，而后兩組間差異無統計學意義(χ2=0.000，P>0.05)。胰腺癌組織XAF1蛋白表達與XFA1基因甲基化呈負相關(r=-0.463，P<0.05)。

圖2胰腺癌(a)和正常胰腺組織(b)的XAF1表達 (免疫組化 ×200 )

3．胰腺癌中XAF1基因啟動子甲基化及蛋白表達與臨床病理特征的關系： XAF1基因啟動子甲基化及其蛋白的表達與臨床分期、腫瘤組織病理分級及有無淋巴結轉移均有關(P值均<0.05)，與患者性別、年齡及腫瘤大小、腫瘤部位均無關(P值均>0.05，表1)。

表1胰腺癌中XAF1基因啟動子甲基化及蛋白表達與臨床病理特征的關系

臨床病理特征例數XAF1基因甲基化(例)χ2值P值XAF1表達陽性(例)χ2值P值性別 男3692.6180.106180.2500.617 女1267年齡(歲) ≤551350.4320.51180.0100.920 >55351017腫瘤部位 胰頭3592.1830.140170.6390.424 胰體尾1368腫瘤大小 ≤33382.4140.120151.8590.173(cm) >315710淋巴結轉移 有191320.2250.00065.2980.021 無29219分化程度 高1314.6050.032104.40850.036 中低351415臨床分期 Ⅰ～Ⅱ25213.1270.000188.2930.004 Ⅲ～Ⅳ23137

討論DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA甲基化轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，將CpG二核苷酸中5′端的胞嘧啶轉變為5′甲基胞嘧啶的過程，即在胞嘧啶的5′碳位共價結合了一個甲基(-CH3)。大量的研究表明，抑癌基因的沉默與其甲基化狀態相關[9-10]。

XAF1基因位于人類染色體17p13.2位點,有8個外顯子，由301個氨基酸組成，分子質量為33 1000，含有7個鋅指結構。XAF1蛋白定位于胞質和胞核內。 XAF1過表達可使細胞停滯于G2/M期，從而抑制腫瘤細胞生長[5]。研究表明，多種腫瘤細胞株及腫瘤組織XAF1 mRNA低表達，如胃癌、結直腸癌、肝癌、腎透明細胞癌、前列腺癌和小細胞肺癌等[10-12]。XAF1 mRNA低表達與XAF1基因啟動子區異常高甲基化有關，且與腫瘤的分期、分級有關[13-15]。

本研究結果顯示，胰腺癌組織XAF1基因的甲基化發生率高于胰腺良性疾病及正常胰腺組織；XAF1蛋白表達陽性率顯著低于胰腺良性疾病及正常胰腺組織，證實XAF1低表達與其啟動子的高甲基化呈負相關。本研究還顯示，胰腺癌組織XAF1蛋白的表達與臨床分期、腫瘤分化程度及有無淋巴結轉移有關，提示XAF1反映胰腺癌的惡性程度及預后，有望成為判斷惡性程度及預后的的生物學指標之一，并有可能為指導胰腺癌的藥物治療提供一個新的思路和靶點。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.019

450052 鄭州，鄭州大學第一附屬醫院肝膽胰腺外科

趙永福，Email:yanghongxing1126@163.com

2012-02-23)

(本文編輯：呂芳萍)