電除顫術后竇房結縫隙連接蛋白40的表達

張燕翔 (武漢大學醫學院法醫學教研室，湖北 武漢 430071；長江大學醫學院病理學教研室，湖北 荊州 434023)

孟祥志，汪 浩，王 春 (武漢大學醫學院法醫學教研室，湖北 武漢 430071)

電除顫術后竇房結縫隙連接蛋白40的表達

張燕翔 (武漢大學醫學院法醫學教研室，湖北 武漢 430071；長江大學醫學院病理學教研室，湖北 荊州 434023)

孟祥志，汪 浩，王 春 (武漢大學醫學院法醫學教研室，湖北 武漢 430071)

目的：探討人工心肺復蘇電除顫術后縫隙連接蛋白40(Connexin40, Cx40)在竇房結(SAN)中的表達。方法：從2008年至2010年成人尸體解剖案例中，篩選出20例，將其中心肺復蘇過程中接受過電除顫者設為A組(n=7)；僅施行標準人工心肺復蘇術而未接受電除顫者設為B組(n=8)；另選取5例正常竇房結組織設為對照組(C組,n=5)。竇房結取材，常規制片，分別行MASSON染色及免疫組化Cx40染色，用圖像分析系統分析每高倍視野竇房結間質比例及竇房結中Cx40表達的IOD值， 統計軟件對所得數據進行分析。結果：A組竇房結間質比例與B組比較、A組與C組比較，差異均有統計學意義(Plt;0.05)；B組與C組比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)；A組SAN中 Cx40表達IOD值與B組比較、A組與C組比較，差異均有統計學意義(Plt;0.05)；B組與C組比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)。結論：電除顫術后SAN間質膠原纖維和彈力纖維網狀結構松散，部分斷裂，水腫，SAN的自我保護功能部分受損；SAN中Cx40表達降低，GJ通道功能受損。

縫隙連接蛋白40；竇房結；法醫病理學；心肺復蘇；電除顫術

人工心肺復蘇(cardiopulmonary resuscitation，CPR)和電除顫術(electrical defibrillation，ED)廣泛應用于臨床急救，然而，在施行過程中亦可對人體造成多種損傷。法醫實踐中，常見肋骨骨折、胸骨骨折等。近年文獻中，CPR及ED對心臟的損傷研究大多局限于心肌[1-2]，而一定強度電流造成心傳導系統損傷的報道則見于電擊死的研究中[3]。CPR和電除顫術造成人體傳導系統損傷少見報道[4-5]。竇房結(sinoatrial node, SAN)是傳導系統的重要組成部分，在心電產生和傳導方面起作用。其心電的產生和傳導需要依賴功能細胞之間的電偶聯來實現，縫隙連接通道(Gap junction, GJ)是實現功能細胞間電偶聯的結構基礎[6-7]。我們通過觀察人體接受CPR及ED術后SAN組織細胞形態及組織結構的變化，并通過SAN縫隙連接蛋白40(Connexin40，Cx40)的表達差異，初步探討CPR及ED對人體SAN功能的影響。

1 材料與方法

1.1主要實驗材料

多克隆兔抗人connexin 40 Ⅰ抗(北京中杉公司)，PV9000免疫組化試劑盒(福州邁新公司)，MASSON三色染色試劑盒(珠海貝索公司)，顯微照相系統(Leica LB-2型，德國)，Image-pro Plus6.0圖像分析系統(Media Cybernetics, USA)。

1.2方法

1.2.1分組 本組資料來源于2008年至2010年武漢大學醫學院法醫司法鑒定所成人尸體解剖133案例，篩選出其中20例，均符合如下標準：①檔案完整，資料齊全，保存有全部的治療搶救記錄。②均于死后24h內進行系統尸體解剖，后經法醫病理學診斷死因明確。③死亡前均無心傳導系統疾病及損傷史，亦無胸部外傷史。④死亡前均接受過心肺復蘇。將其中7例心肺復蘇過程中接受過電除顫者設為實驗組(A組)；僅施行心肺復蘇術而未接受電除顫者8例設為B組；選取5例未接受過心肺復蘇搶救，經法醫病理學檢查證實生前無心臟及傳導系統疾病者設為對照組(C組)。

1.2.2取材、制片及染色 采用宋一璇[8]改良的心臟傳導系統解剖法，獲取死者心臟竇房結樣本，10%中性甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(4～6μm)分別作HE染色、MASSON三色特殊染色、免疫組織化學染色。MASSON三色特殊染色前切片脫蠟至水，后浸入Bouin氏固定液37°溫箱處理2h，水洗后再行染色，具體步驟參照試劑盒附帶說明書，甲苯胺藍復染，中性樹膠封固；免疫組織化學具體步驟參照說明書，每例均以PBS液代替Cx40一抗作為陰性對照，以試劑盒附送的陽性片作為陽性對照，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。

1.2.3圖像分析 MASSON三色特殊染色切片利用Image-pro Plus6.0圖像分析系統，高倍鏡下隨機選取5個視野(×400)，統計每高倍視野竇房結間質所占比例，每高倍視野竇房結間質比例(%)=(每高倍視野竇房結間質面積/每高倍視野竇房結組織面積)×100%。

免疫組化切片均隨機選擇5個視野，在高倍視野下(×400)利用Image-pro Plus6.0圖像分析系統，進行各組竇房結Cx40表達的半定量分析，測定積分光密度值 (Integrated Optical Density，IOD)，比較Cx40含量變化情況。

1.3統計學分析

2 結 果

2.1一般形態觀察結果

人SAN鏡下HE染色較淡，能明顯與周圍心房肌區別開。A組起搏細胞(P細胞)邊界不清，腫脹明顯，胞核染色加深或核內空亮，染色質邊集，胞漿嗜堿性，部分P細胞見散在的細胞核固縮，移形細胞(T細胞)亦腫脹，橫紋模糊，辨識不清，局部可見零星立方形T細胞，SAN間質疏松化，間質水腫，毛細血管明顯擴張充血，但各例肉眼及鏡下均未見出血。B組與C組鏡下變化差異并不明顯，P細胞、T細胞顯露清楚，P細胞小而短，橫切呈短棒狀或卵圓形，胞質淡染，間質亦有輕度水腫，毛細血管擴張充血；T細胞大多位于周邊區，體積比P細胞大，細胞形態狹長，核呈長梭形。3組鏡下SAN實質間質成分相互混雜，界限不清，HE染色下無法清晰比較P細胞、T細胞及結締組織結構和細胞數目的變化。

2.2MASSON染色結果

SAN采用Mssson三色染色結果細胞核為藍色，細胞質、肌纖維和紅細胞呈紅色，膠原纖維呈藍色，實質間質辨析清楚，P細胞、T細胞和結締組織區別明顯，肌纖維橫紋顯示良好。A組膠原纖維和彈力纖維網狀結構局部連續性中斷，毛細血管擴張，未見出血改變(見圖1)。竇房結間質比例較B組、C組明顯降低，差異有統計學意義(Plt;0.05)，B組與C組相比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)(見表1)。

(a) A組竇房結間質膠原纖維和彈力纖維網狀結構局部連續性中斷，毛細血管擴張；(b)實質間質辨析清楚，P細胞、T細胞和結締組織區別明顯，肌纖維橫紋顯示良好；(c)正常對照組。

2.3免疫組化Cx40表達結果

表1 各組竇房結高倍鏡下間質比例和Cx40表達IOD值比較

尸檢所得人體心臟SAN 中棕黃色Cx40免疫陽性顆粒呈團塊狀聚集, 分布不均，細胞膜上或彌散入胞漿表達,多聚集于細胞的側側或端端連接處, Cx40在心肌的表達較SAN內多。在SAN內，Cx40在P細胞、T細胞表達稀疏，多分布于中心區結動脈周圍，SAN周邊部分布極少，但在SAN的傳導纖維內表達明顯(見圖2)。A組SAN Cx40表達IOD值較B組、C組明顯降低，差異有統計學意義(Plt;0.05)，B組與C組相比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)(見表1)。

(a) Cx40 免疫陽性顆粒呈團塊狀聚集, 分布不均，細胞膜上或彌散入胞漿表達,多聚集于細胞的側側或端端連接處,A組表達降低；(b)B組Cx40竇房結中陽性表達與C組差異并不顯著；(c)正常對照組。

3 討 論

當心搏驟停發生時，迅速而有效的采取CPR，能提高搶救的成功率，心搏驟停患者大約有80%～90%第一個捕獲的心電圖是室顫, 因而盡早實施ED是治療室顫的有效手段,除顫越早, 成功率越高[9-10]。除顫器產生強度可控的脈沖電流作用于心臟, 瞬間電流強度可達360J或者更高，強迫所有心肌細胞在瞬間幾乎全部處于除極狀態，造成瞬間停搏，這樣就有可能讓自律性最高的竇房結重新起搏心臟，控制心搏轉復為竇性心律[11]。但在搶救患者生命的同時，可能產生有害效應，包括細胞膜斷裂、電擊后阻滯、機械性功能不良和新的快速心律失常[12]。

在法醫實踐中，電擊死者SAN的組織病理學觀察其形態變化包括點、片狀出血，P細胞、T細胞濁腫、傳導纖維濁腫，嚴重時甚至可見液化性壞死等表現[13]。我們觀察常規HE染色鏡下A組表現與其大致相符，但均未見心內膜下出血及液化性壞死等現象，B組和C組鏡下觀察無異常；提示在施行電除顫術后，可能造成竇房結損傷。而鏡下未能觀察到如電擊死者所具有的心內膜下出血及液化性壞死等現象的原因，考慮為醫用除顫器電流強度雖然瞬間可達到360焦耳甚至更高，但刺激時間較短，其傷害程度較電擊輕。

在心傳導系統以及SAN的研究中，間質變化特點一直是不容忽視的要點之一。MASSON三色染色法能夠清晰顯示SAN膠原纖維和彈力纖維網狀結構支架，使得主質與間質對比清楚；同時，MASSON三色染色法能更好將SAN中P與T細胞區別開，使功能心肌細胞橫紋顯示更加清楚。本實驗結果表明，在光學顯微鏡下觀察人體SAN形態，MASSON染色顯然較傳統的HE染色更加適合。本實驗同時發現，A組SAN間質比例較B組、C組明顯降低，差異有統計學意義(Plt;0.05)，B組與C組相比較，差異無統計學意義(Pgt;0.05)。這一結果說明，心電除顫電流刺激可造成SAN間質膠原纖維和彈力纖維網狀結構松散，局部斷裂，間質水腫， SAN的自我保護功能部分受損；而B組以單純的胸外心臟按壓，雖然亦可觀察到SAN間質水腫和毛細血管的擴張，但其程度明顯較A組為輕。

GJ是相鄰心肌細胞膜之間形成的特化區域，在細胞間起代謝耦聯和電耦聯作用,完成細胞之間的電化學信息交換，是維持電生理搏動的結構基礎。GJ由相鄰心肌細胞胞膜上的縫隙連接蛋白半通道(connexin hemichannels)對接形成連接小體，每個半通道則由6個縫隙連接蛋白(Connexin, Cx)構成[7]，其通道功能主要受到細胞內Ca2+濃度、pH值變化以及神經激素的調節[14-15]。Kwong等[16]通過對成年犬的研究發現，竇房結中大約有55%細胞只表達Cx40，宋慧芳等[7]針對人體竇房結的實驗研究也證明，人體竇房結中縫隙連接蛋白的表達以Cx40為主，其他類型的連接蛋白分布稀少。亦有研究表明，Cx40的表達異常與各種類型的心律失常特別是房顫的持續存在密切相關[17-19]。以上結論說明，SAN電沖動的產生、傳導以及心律的維持與Cx40密切相關。本實驗觀察到，SAN 中棕黃色Cx40 免疫陽性顆粒呈團塊狀聚集,中心區結動脈周圍分布相對較多，而SAN周邊部分布少，可能與SAN中心區P細胞產生的心電沖動集中整合，保證結優勢起搏點能夠集聚充分的起搏沖動后傳導有關；Cx40在心肌的表達較SAN內表達多，說明心電沖動在SAN內傳導可能較慢，符合SAN能自動發出興奮但不能很快傳導的電生理特性。本實驗A組SAN中 Cx40表達IOD值較B組、C組明顯降低，其IOD值下降，差異有統計學意義(Plt;0.05)。Cx40在電除顫組中的表達明顯減少的可能機制是：心臟遭受除顫電流刺激后，間質膠原纖維和彈力纖維網狀結構松散，部分斷裂，SAN的自我保護與興奮傳導隔離功能部分受損；同時除顫電流刺激強迫所有心肌細胞在瞬間幾乎全部處于除極狀態，部分受損SAN細胞細胞膜斷裂，GJ通道損傷，電流刺激使通道蛋白活性喪失；此外，電流刺激亦可使細胞膜上的鈉鉀泵、鈣泵運轉失靈，局部離子濃度發生變化，進一步影響GJ通道的正常功能；而B組與C組Cx40表達差異并不顯著，說明對心肌單純的機械刺激并未造成通道蛋白的活性喪失。

綜上所述，對人體施行人工心肺復蘇和電除顫術后SAN間質膠原纖維和彈力纖維網狀結構松散，部分斷裂，水腫，SAN的自我保護功能部分受損；SAN中Cx40表達降低，GJ通道蛋白活性部分喪失。

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[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.01.002

R361

A

1673-1409(2012)01-R004-04

2011 11 27

張燕翔(1975)，男，湖北荊州人，實驗師，碩士生，主要從事心血管病理與猝死研究；通訊作者：孟祥志，EMAil：mxz63@hotmAil.Com。