補(bǔ)腎化痰方對(duì)去卵巢大鼠骨髓細(xì)胞Cbfαl、BGP mRNA表達(dá)的影響

胡 婭(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023；湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430061)

蹇順華，向 楠(湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430061)

補(bǔ)腎化痰方對(duì)去卵巢大鼠骨髓細(xì)胞Cbfαl、BGP mRNA表達(dá)的影響

胡 婭(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023；湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430061)

蹇順華，向 楠(湖北中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430061)

目的：觀(guān)察補(bǔ)腎化痰方對(duì)去卵巢(OVX)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨髓細(xì)胞中核結(jié)合因子αl(Cbfαl)和骨鈣素(BGP)mRNA表達(dá)的影響。方法：SD大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，術(shù)后3月以補(bǔ)腎化痰方灌胃給藥，連續(xù)8周；處死大鼠，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)大鼠骨髓細(xì)胞Cbfαl和BGP mRNA的表達(dá)。結(jié)果：補(bǔ)腎化痰方中、高劑量組Cbfαl mRNA和 BGP mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.01)。結(jié)論：補(bǔ)腎化痰方通過(guò)上調(diào)Cbfα1和BGP的基因表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥有較好的治療作用。

補(bǔ)腎化痰方；骨質(zhì)疏松癥；核結(jié)合因子αl(Cbfαl)；骨鈣素(BGP)

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種由多種原因引起的全身性骨骼疾病,它以骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化，骨量減少為主要特征,導(dǎo)致骨的脆性增加而容易發(fā)生骨折[1]。臨床上主要表現(xiàn)為腰背肢體疼痛, 病理骨折，身體畸形,或伴有原發(fā)疾病表現(xiàn)。本病屬于中老年人的一種退行性病變，發(fā)病率高，嚴(yán)重危害中老年健康，已成為老齡化社會(huì)衛(wèi)生保健突出問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨髓細(xì)胞Cbfαl mRNA和 BGP mRNA表達(dá)的變化，探究補(bǔ)腎化痰方調(diào)節(jié)骨代謝的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 藥品 補(bǔ)腎化痰方由菟絲子30g、淫羊藿10g、補(bǔ)骨脂15g、全瓜蔞15g、紅曲12g和生山楂20g組成，生藥由湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門(mén)診部中藥房提供，加水煎煮，過(guò)濾，并濃縮，配制成0.94g/ml和1.88g/ml兩個(gè)濃度的生藥混懸液，密封貯存于4℃冰箱備用。利維愛(ài)(南京歐加農(nóng)制藥有限公司，2.5 mg/片，批號(hào)：LK-4305-10)。

1.1.2 試劑 TRIzol Reagent(美國(guó)invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)invitrogen公司)，Taq DNA聚合酶(大連寶生物工程有限公司)，PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8月齡雌性SD大鼠，清潔級(jí)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供，許可證號(hào)SCXK(鄂)2004-0007。

1.1.4 儀器 Biometra PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)), DYY-6C瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備(北京六一儀器廠(chǎng))，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng))，WD-9403C紫外透射儀(北京六一儀器廠(chǎng))，labofuge400R離心機(jī)(Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1 去卵巢大鼠模型的建立和分組 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、西藥組、中藥中劑量組、中藥高劑量組。除對(duì)照組外，其他各組大鼠均行卵巢切除術(shù)。麻醉后，無(wú)菌條件下行背部肋下雙側(cè)卵巢切除。假手術(shù)組術(shù)式相同，但不摘除卵巢，僅切除少量卵巢周?chē)窘M織。手術(shù)3個(gè)月后開(kāi)始灌胃給藥，中藥組以補(bǔ)腎化痰方按體質(zhì)量灌胃，中劑量組9.4g/kg，高劑量組18.8g/kg；西藥組則予以利維愛(ài)0.23 mg/kg，對(duì)照組、假手術(shù)組予以等體積的生理鹽水，1次/d，給藥時(shí)間為8周。期間各組大鼠分籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。

1.2.2 骨髓細(xì)胞Cbfαl mRNA、BGP mRNA表達(dá)的測(cè)定 無(wú)菌狀態(tài)下取出大鼠的左側(cè)股骨，去除附著的肌肉及軟組織后，剪短兩端骨垢端，刮取骨髓腔內(nèi)骨髓組織，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)BGPmRNA、CbfαlmRNA表達(dá)。 Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。Cbfαl引物序列：上游引物5′-CTACTCTGCCGAGCTACGAAAT-3′，下游引物5′- TCTGTCTGTGCCTTCTTGGTTC-3′。BGP引物序列：上游引物5′-AGCAGGAGGGCAGTAAGGT-3′，下游引物5′- TGTGCCGTCCATACTTTCG-3′。β-actin序列：上游引物5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，下游引物5′-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。擴(kuò)增條件：94℃變性30 s，58℃退火30s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后，72℃終末延伸5min，降至4℃取出。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用圖像分析儀對(duì)擴(kuò)增條帶的光密度進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算該基因與β-actin基因的光密度比值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

與假手術(shù)組相比，模型組的CbfalmRNA表達(dá)水平明顯下降(Plt;0.01)；中藥高劑量組、中藥中劑量組以及西藥治療組在用藥2個(gè)月后，可明顯上調(diào)BGPmRNA和CbfαlmRNA的表達(dá)水平，與模型組相比較，Plt;0.01。

表1 各組大鼠骨髓細(xì)胞BGP mRNA、Cbfαl mRNA的表達(dá)

注：與模型組相比，**Plt;0.01；與假手術(shù)組比較，ΔPlt;0.05，ΔΔPlt;0.01。

圖1 大鼠骨髓細(xì)胞Cbfαl mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 大鼠骨髓細(xì)胞BGP mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討 論

骨質(zhì)疏松的直接原因是骨形成和骨吸收所組成的骨重建過(guò)程的失衡，而骨的形成主要由成骨細(xì)胞完成。成骨細(xì)胞是骨發(fā)生和骨形成的物質(zhì)基礎(chǔ)，在骨不斷的更新活動(dòng)中是最重要的功能細(xì)胞，Cbfαl是成骨細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于成骨細(xì)胞分化具有重要意義，Cbfαl可以誘導(dǎo)其下游的一系列成骨相關(guān)基因(如骨鈣蛋白、Ⅰ型膠原蛋白、骨橋蛋白等)的表達(dá)，研究證實(shí)它是控制骨形成的關(guān)鍵因子[2-3]，敲除此基因可導(dǎo)致成骨細(xì)胞發(fā)育被抑制及顯著的骨發(fā)育不良或者不發(fā)育。Cbfα1的表達(dá)受多種因子的影響,其中BMPs是調(diào)節(jié)Cbfα1表達(dá)的一類(lèi)重要生長(zhǎng)因子, 我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示補(bǔ)腎化痰方能增強(qiáng)OVX大鼠BMP-2表達(dá)[4]，推測(cè)補(bǔ)腎化痰方可能是通過(guò)上調(diào)BMP-2，進(jìn)而促進(jìn)Cbfαl表達(dá),并啟動(dòng)Cbfα1下游的一系列成骨相關(guān)基因的表達(dá),從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、增殖及骨的發(fā)育、生成。

成骨細(xì)胞能分泌多種因子及蛋白，其中骨鈣素是成骨細(xì)胞分化成熟的特異性指標(biāo)之一，為最主要的評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞活性的指標(biāo)。骨鈣素(bone glaprotein，BGP)也稱(chēng)骨γ-羧基谷氨酸蛋白，是由成熟的成骨細(xì)胞合成的一種非膠原蛋白，BGP的主要生理功能是維持骨正常鈣化速率,抑制異常羥磷灰石結(jié)晶形成，抑制軟骨礦化速率，可直接反映成骨細(xì)胞的活性和骨生理代謝變化[5-6]。本實(shí)驗(yàn)中模型組OVX大鼠骨髓細(xì)胞BGP mRNA表達(dá)水平明顯低于假手術(shù)組(Plt;0.01)，也反映出模型組大鼠的成骨細(xì)胞活性下降。而補(bǔ)腎化痰方組BGP mRNA表達(dá)明顯高于模型組(Plt;0.01)，提示補(bǔ)腎化痰方能夠刺激成骨細(xì)胞活性，使骨形成活動(dòng)增強(qiáng)。

骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)“骨痿”、“骨痹”、“腰痛”、“骨枯”、“骨極”的范疇。補(bǔ)腎法歷來(lái)被作為治療腎虛骨質(zhì)疏松癥的主要療法, 研究證實(shí)補(bǔ)腎中藥能促進(jìn)骨形成[7]，使OVX骨質(zhì)疏松模型大鼠產(chǎn)生較多的骨基質(zhì), 使類(lèi)骨質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榈V化骨小梁，但究竟如何促進(jìn)骨形成尚需深入研究。本實(shí)驗(yàn)提示補(bǔ)腎化痰方可通過(guò)上調(diào)Cbfα1的基因表達(dá)，并啟動(dòng)其下游的一系列成骨相關(guān)基因如BGP的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)骨重建過(guò)程中骨形成的主導(dǎo)方向，改善骨質(zhì)疏松病理狀態(tài)。

[1]劉忠厚，楊定焯，朱漢民，等.中國(guó)人原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，1995，5(1)：1-3.

[2]Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, et al. Osf2/Cbfa1:a transcriptional activator of osteoblast differentiation[J]. Cell，1997，89(5)：747-754.

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[4]胡婭，蹇順華，向楠，等.補(bǔ)腎化痰方對(duì)去卵巢大鼠骨組織中BMP-2和TGF-β1表達(dá)的影響[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，13(1)：16-17.

[5]冼華，曹文富.補(bǔ)骨防疏煎劑對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠血清骨鈣素的影響[J].中國(guó)藥房，2011，22(19)：1751-1753.

[6]薛蔭昌，賈玉巧，許秀輝，等.大鼠骨質(zhì)疏松模型中骨堿性磷酸酶、白細(xì)胞介素-6及骨鈣素的表達(dá)[J]. 職業(yè)與健康，2010，26(6)：608-610.

[7]潘偉軍，曾昭明，黃宏興.補(bǔ)腎益精法治療更年期婦女骨質(zhì)疏松的臨床觀(guān)察[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，7(4)：30-31.

[編輯] 一 凡

R681.1；R242

A

1673-1409(2012)04-R001-03

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.04.001

2012-03-28

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)基金項(xiàng)目(200805070003)。

胡婭 (1978-)，女，湖北荊州人，講師，博士，主要從事中藥基礎(chǔ)與臨床藥理研究；通訊作者：向楠，E-mail：xiangnan61@sina.com。