多重耐藥鮑曼不動桿菌耐消毒劑、滅菌劑基因研究

侯明玖(江陵縣人民醫院檢驗科，湖北 江陵 434100)

曾 明(湖北省臨床檢驗中心，湖北 武漢 430064)

侯玲俐，楊宏偉(湖北醫藥學院附屬太和醫院，湖北 十堰 442000)

多重耐藥鮑曼不動桿菌耐消毒劑、滅菌劑基因研究

侯明玖(江陵縣人民醫院檢驗科，湖北 江陵 434100)

曾 明(湖北省臨床檢驗中心，湖北 武漢 430064)

侯玲俐，楊宏偉(湖北醫藥學院附屬太和醫院，湖北 十堰 442000)

目的：了解多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株的消毒劑與磺胺類抗菌藥物耐藥相關基因存在狀況，揭示鮑曼不動桿菌的耐藥機制。方法：瓊脂稀釋法測定醫院常用消毒劑的MIC，并用PCR法檢測I類整合子標志物之一的qacE△1-sul1 同時也是消毒劑耐藥基因。結果： 20株多重耐藥鮑曼不動桿菌對醫院常用消毒劑苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)的MIC分別為8～32μg /ml之間，高于對照菌的MIC； qacE△1-sul1基因陽性率100%。結論： 多重耐藥鮑曼不動桿菌對醫院常用消毒劑苯扎溴銨和二氯異氰尿酸鈉表現為耐藥；I類整合子標志物之一的消毒劑與磺胺類等抗菌藥物耐藥相關基因(qacE△1-sul1) 攜帶率較高，與消毒劑與復方新諾明耐藥表現一致，說明細菌攜帶qacE△1-sul1基因是消毒劑、滅菌劑耐藥的主要因素。

鮑曼不動桿菌；多重耐藥；耐藥機制

多重耐藥鮑曼不動桿菌(multi-drug resistant Acinetobacter baumannii, MDRAB)是重要的醫院內感染病原菌之一，可引起院內感染的暴發流行。在醫院感染控制中消毒劑起著重要的作用[1]，目前各種消毒劑在醫院應用十分廣泛，與其它抗生素一樣，細菌對醫院常用消毒劑的耐藥也越來越廣泛。國內外不同地區的學者近年來已從MDRAB中均檢測出攜帶耐消毒劑基因的菌株[2-3]。我們對多重耐藥鮑曼不動桿菌20株對醫院常用消毒劑苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)的耐藥性及其相關基因(qacE△1-sul1)進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株來源 2009年度從太和醫院住院患者的痰、尿液、傷口分泌物等標本中分離出的20株多重耐藥鮑曼不動桿菌，經VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定藥敏系統鑒定，并作基因檢測。質控菌株：銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2 儀器 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定藥敏系統(法國梅里埃公司)，PE700型DNA擴增儀(美國PE公司)，G-BOX ND200凝膠成像儀(美國基因公司)。

1.2方法

1.2.1 抗菌藥物原液配制 稱取抗菌藥物(抗菌藥物苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)干粉，按藥典推薦的溶解劑溶解，將藥物分別配制成5120μmol/L的抗菌藥物原液，經過過濾后，在-20℃冰箱冷藏。根據以下公式計算藥物干粉用量[4]：

質量(mg)=溶劑(ml)×濃度(mg/ml)/分析效能

1.2.2 含藥M-H瓊脂平板制備 藥物原液，用雙蒸水稀釋，使藥物的終濃度(μg/ml)分別為5120、2560、1280、640、320、160、80、40、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3。稱取M-H干粉38g加入蒸餾水920ml，溶解后，將pH調整至7.4，在121℃下滅菌15min，冷卻至50℃左右，用量筒量取22.5ml溶液傾注于直徑為9cm的無菌培養皿，快速加入相相應的抗菌藥物稀釋液2.5ml，對照平板則加入2.5 ml無菌蒸餾水，就配成含不同濃度藥物的M-H平板，自然冷卻，無菌試驗合格后置2～8℃冰箱冷藏備用[5]。

1.2.3 顯色藥敏 (MIC)測定 采用瓊脂稀釋法測定苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)的MIC。瓊脂稀釋法嚴格按美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)2008版[5]操作。挑取培養好的單個菌落，用生理鹽水配成0.5麥氏濁度的細菌懸液，將細菌懸液與生理鹽水再稀釋10倍，吸取菌液約1～2μl接種于含藥M-H瓊脂平板表面，同時接種生長對照平板。35℃溫箱孵育24h后判斷結果。判斷界值標準參照CLSI M100-S18[5]進行。

1.2.4 耐藥基因檢測 根據GenBank公布的耐藥基因序列，用Primer Premier 5.0軟件自行設計引物，qacE△1-sul1引物：P1：5′-TAGCGAGGGCTTTACTAAGC；P2：5′-ATTCAGAATGCCGAACACCG。其擴增后產物長度300bp。細菌DNA提取：雙蒸水法，挑取細菌加入含250μl無菌雙蒸水的EP管，沸水浴5min，離心(13000rpm)10min，取上清即為細菌DNA。

基因擴增：PCR法，反應體系：Taq酶(5U/μl) 0.2μl，MgCl22μl，dNTP 1.25μl，10×Buffer 2.5μl，引物各1μl，標本1μl，ddH2O14.8μl，SYBR 1.25μl，反應總體積為25μl。反應條件：94℃預變性2min(1個循環)， 94℃30s、55℃30s 、72℃45s(30個循環)， 72℃7min(1個循環)。

基因檢測：2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR擴增產物加入凝膠的點樣孔，以 DNA Marker作對照；電壓60V，4.5h電泳。電流后在凝膠成像分析儀上成像(以ATCC25922及空白為陰性對照)。

2 結 果

2.1顯色藥敏結果

20株多重耐藥不動桿菌測定的苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)MIC結果見表1。

表1 苯扎溴銨和二氯異氰尿酸鈉的MIC結果及基因檢測結果

圖1 qacE△1-sul1基因PCR產物電泳圖

2.2基因檢測結果

PCR 產物電泳圖見圖1 。20株多重耐藥不動桿菌耐消毒劑基因(qacE△1-sul1) 陽性率為100%。

3 討 論

目前鮑曼不動桿菌已經成為各級醫院最難以治療和控制的醫院感染病原菌之一。在醫院感染控制過程中消毒劑應用十分廣泛，醫院感染的各種細菌在低劑量或亞致死劑量消毒劑的作用下，受到選擇壓力的作用，產生耐藥性。因此細菌對各種消毒劑的耐藥現象已經成為醫院感染控制研究的新的領域。國內外已發現多種菌株對消毒劑產生了耐藥性，例如對雙胍類、酚類、季銨鹽類、醇類、碘等的耐藥性[6-7]。作者對20株多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株對目前醫院常用和消毒劑苯扎溴銨和二氯異氰尿酸鈉進行了MIC測定，其MIC均在8～32μg/ml，均高于標準株的4μg/ml和1μg/ml的水平，研究結果提示對MDRAB醫院常用消毒劑苯扎溴銨(新潔爾滅)和二氯異氰尿酸鈉(潔消精)耐藥。細菌攜帶qacE△1-sul1基因是其對醫院常用消毒劑耐藥的主要因素，其中qac基因所編碼的Qac蛋白是膜蛋白型的多藥轉運蛋白，其可介導對親脂性消毒劑(Quatemary Ammonium Compounds，Qac)外排。如果細菌獲得這一基因并開始表達則細菌將雙胍類(如氯已定)、季胺類(如苯扎溴銨) 、堿性染料、腙類化合物等排出細菌體外。目前已發現的qac基因家族有A、B、C、D、E、E△1、F、G、H、J等10種，其中由整合子介導的qacE△1基因，廣泛的存在于革蘭陽性菌和陰性菌[8-10]。sull基因可編碼二氫葉酸合成酶，這一基因陽性則提示細菌對磺胺類藥物耐藥。qacE△l基因和sull基因為重疊基因，存在于I類整合子的3′保守端。本文作者在qacE△1下游和sul1上游分別設計引物P1、P2，基因擴增陽性則表示qacE△l和sul1基因同時存在。I類整合子在整合子介導的細菌耐藥機制中起著十分重要的作用，目前用來檢測I類整合子最常用且最有效的方法就是用PCR擴增方法檢測Ⅰ類整合子的intI1 和(或) qacE△1標志物。我們用PCR法檢測消毒劑耐藥相關基因(qacE△1-sul1)，檢測結果發現20株多重耐藥的鮑曼不動桿菌的相關基因的陽性率為100%。

本實驗結果提示本地區多重耐藥鮑曼不動桿菌對目前臨床常用的消毒劑的MIC值均不同程度高于標準菌株，細菌的耐藥基因檢測均為陽性，說明本地區的MDRAB菌株對消毒劑產生了耐藥趨勢，因此醫院感染控制部門應對這一現象引起高度關注。這一結果還提示醫院相關部門和廣大醫務工作者需要高度重視在醫院內規范使用消毒劑的的問題，同時加強醫院各項消毒管理制度，提高醫護人員對手衛生的重視，防止消毒劑耐藥的菌株的在醫院內的傳播，從而減少醫院感染的發生。

[1]林輝，鄭劍.銅綠假胞菌對消毒劑抗藥性的研究進展[J].中國消毒學雜志，2007，24(3)：269-271.

[2]黃支密，糜祖煌，石曉霞，等.醫院感染革蘭陰性桿菌耐消毒劑基因研究[J].中華醫院感染學雜志，2005，15(7)：721-724.

[3]Kaxama H，Hamashima H，Sasatsc M，et al.Distribution of the antiseptic-resistance genes qacE and qacE deta 1 in gram-negative bactria[J].FEMS Miroobiol Lett，1998，159(2)：173-178.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京：化學工業出版社，2000.

[5]Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. 18ed. Approved standard M2-A9 (M100-S18). CLSI，2008：116-118.

[6]Jain R，Danziger L H.Multidrng-resistant Acinetobacter infections：an emerging Challenge to clinicians[J].Ann Pharmacother，2004，38(9)：1449-1459.

[7]王震宇.細菌對消毒劑抗性研究進展[J].中國消毒學雜志，2007，24(2)：169-173.

[8]Mitchell B A，Brown M H，Skurray R A.QacA multidrug emux pump from staphylococcus：comparative analysis of resistance to diamidines，biguanines，and guanylhydragones[J].Antimicrob Agents Chemother，1998，42(2)：475-477.

[9]Mayer S，Boos M，Beyer A，et al.Distribution ofthe antiseptic resistance genes qacA，qacB and qacC in 497 methicillin-resistant and susceptible European isolates of Staphylococcus aureu[J].J Antimicrob Chemother，2001，47(6)：986-997.

[10]Ploy M，Courvalin P，Lambert T.Characterization of Entembacter aerogenes BM2688.a class l integron with two new gene cassettes，cmlA2 and qacF[J].Antimicmb Agents Chemotber，1998，42(10)：2557-2563.

[編輯] 一 凡

R446.5

A

1673-1409(2012)04-R062-03

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.04.031

2012-03-02

湖北省十堰市科技攻關項目(2009S25)

侯明玖(1972-)，男，湖北荊州人，主管技師，主要從事臨床檢驗工作；通訊作者：侯玲俐，E-mail：472230556@qq.com。