帕金森病大鼠發(fā)病過(guò)程中紋狀體區(qū)乙酰膽堿水平動(dòng)態(tài)變化及行為學(xué)觀察

曹 非 駱 芳 陳 涵 魏桂榮 喬 嫻 孫圣剛 梅元武 童萼塘

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430022)

帕金森病(PD)是一種慢性退行性神經(jīng)變性疾病，其發(fā)病原理是多因素導(dǎo)致黑質(zhì)致密部的多巴胺神經(jīng)元變性缺失，引起多巴胺(DA)含量降低，DA-乙酰膽堿(Ach)平衡失調(diào)，造成Ach系統(tǒng)功能相對(duì)亢進(jìn)從而致病。目前有關(guān)于PD發(fā)病中Ach動(dòng)態(tài)改變罕見(jiàn)報(bào)道。本研究據(jù)此采用大鼠PD模型，動(dòng)態(tài)觀察紋狀體Ach變化，同時(shí)觀察相應(yīng)PD大鼠行為學(xué)改變。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇與分組 選用健康Wistar雄性大鼠36只(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重180～200 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)條件室溫，光照每日14 h，自由飲食和水。經(jīng)檢測(cè)無(wú)旋轉(zhuǎn)行為后隨機(jī)分為四大組。A：正常組，B、C、D 三組行 6-羥基多巴胺(6-OHDA)注射液注射。6-OHDA注射液：6-OHDA、維生素C干粉劑(Sigma公司產(chǎn)品)按2.5∶1的比例用生理鹽水配制成0.3%6-OHDA注射液，即配即用，密封、低溫、避光保存。腦立體定位注射術(shù)，觀察時(shí)點(diǎn)為注射6-OHDA 后1、7、14、21 d。B：術(shù)后7 d 組，C：術(shù)后14 d組，D：術(shù)后21 d組，A、B、C、D 組各9只大鼠。

1.2 PD大鼠模型制作 按改良的Thomas方法〔1〕制作PD大鼠模型：大鼠用7%水合氯醛(0.6 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，頭顱水平位固定在腦立體定位儀(西北光學(xué)儀器廠制造)上，上切牙平面比耳間線平面低2.4 mm(即齒棒低于耳間線)2.4 mm，保證前、后囟處于同一水平面，各個(gè)方向輕輕搖動(dòng)證明頭部確實(shí)固定可靠后進(jìn)入下一步;剃除大鼠頭頂部毛發(fā)，手術(shù)區(qū)碘酒酒精消毒，于顱中部正中切開(kāi)頭皮和筋膜，切口長(zhǎng)度1.5 cm，剝離骨膜，棉球蘸取純雙氧水使前囟充分暴露，參照包新民等著《大鼠立體定位圖譜》確定右側(cè)黑質(zhì)致密部、中腦腹側(cè)被蓋部(VTA)三維坐標(biāo)位置，SNc區(qū)坐標(biāo)：前囟后4.8 mm，中線右側(cè)2.0 mm，硬膜下7.5 mm，VTA區(qū)坐標(biāo)：前囟后4.4 mm，中線右側(cè)1.2 mm，硬膜下7.5 mm，用腦外科電動(dòng)顱骨鉆鉆顱孔(直徑3 mm)2個(gè)，用10 μl微量注射器抽取0.3%6-OHDA，按坐標(biāo)每個(gè)點(diǎn)注射3.3 μl，注射時(shí)緩慢進(jìn)針，注意針尖斜面向尾側(cè)，注射速度 0.5 μl/min，注射完畢，停針 10 min，在按1.0 mm/min速度緩慢拔針，明膠海綿填塞顱骨孔，縫合皮膚筋膜，馬應(yīng)龍軟膏涂抹縫線處，術(shù)后大鼠包被保暖，清醒后置籠喂養(yǎng)。

1.3 高效液相電化學(xué)方法測(cè)紋狀體多巴胺及代謝產(chǎn)物的含量

1.3.1 樣品制備 四個(gè)時(shí)點(diǎn)組行為學(xué)測(cè)試后，分別隨機(jī)選擇成模大鼠行單胺類遞質(zhì)含量的測(cè)定。與上午九點(diǎn)斷頭取腦，在冰臺(tái)上快速取出雙側(cè)紋狀體，稱重，臨時(shí)保存于液氮中，后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱。待測(cè)時(shí)按30 μl/10 mg加入0.05 mol/L的高氯酸，除去蛋白，在冰浴中用玻璃勻漿器混合勻漿，勻漿液于4℃低溫離心，取上清液加樣行高效液相色譜電化學(xué)檢測(cè)。

1.3.2 Ach高效液相色譜分析〔1〕將動(dòng)物斷頭取腦，在冰臺(tái)上迅速分離紋狀體，稱重，于液氮中保存。測(cè)定組織乙酰膽堿含量時(shí)，在含0.04%(W/V)Na2S2O5和0.04%(W/V)依地酸的0.1 mol/L(1 ml/0.1 g腦組織)的冰過(guò)氯酸(PCA)中20 s組織勻漿。組織勻漿液4℃離心。超浮游物0.2 μm多孔板過(guò)濾，每1 ml放于1.5 ml瓶中，－80℃儲(chǔ)存。樣品測(cè)Ach時(shí)以緩沖液1∶2體積稀釋后注入高效液相色譜系統(tǒng)〔2〕。DA的檢測(cè)在按30 μl/10 mg加入0.1 mol/L高氯酸，冰浴下勻漿，高速低溫離心機(jī)離心，取上清供檢測(cè)〔3〕。

1.4 行為學(xué)觀察 大鼠在預(yù)定時(shí)點(diǎn)的第二天上午8點(diǎn)進(jìn)行行為學(xué)觀察，通過(guò)腹腔注射APO 0.5 mg/kg，在直徑為40 cm的不銹鋼盆中觀察大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，時(shí)間2 h，用鐘式測(cè)轉(zhuǎn)儀測(cè)量旋轉(zhuǎn)次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 紋狀體Ach含量 模型組Ach的含量呈現(xiàn)逐漸變化的趨勢(shì)，在7 d組沒(méi)有明顯變化;14 d，21 d組逐漸上升，與空白對(duì)照組對(duì)比有顯著性差異(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 行為學(xué)觀察 給予阿樸嗎啡腹腔注射，5～10 min后可觀察到大鼠有嗅探，閉眼，僵直，肌震顫，不久開(kāi)始出現(xiàn)向注射對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)時(shí)大鼠身體向左側(cè)曲成環(huán)狀，首尾相接，以左后肢為支點(diǎn)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥7 r/min為成功模型。正常對(duì)照組未出現(xiàn)任何行為學(xué)變化，B、C、D組隨著時(shí)間增加，大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)7 d的4 r/min猛增到21 d的313 r/min。見(jiàn)表1。

表1 PD大鼠紋狀體區(qū)Ach、大鼠旋轉(zhuǎn)行為比較(s)

表1 PD大鼠紋狀體區(qū)Ach、大鼠旋轉(zhuǎn)行為比較(s)

與A組比較：1)P＜0.05;與 B組比較：2)P＜0.05;與C組比較：3)P＜0.05

組別 n 旋轉(zhuǎn)圈數(shù)(r/min)Ach含量(μg/g)A組19.67±7.40 B組 9 4.22±1.86 21.08±4.27 C組 9 10.29±2.211)2) 27.86±6.401)2)D組 9 313.38±2.921)2)3) 31.74±10.031)2)3)9 0

3 討論

Lacroix〔1〕認(rèn)為PD發(fā)病的根本原因就是黑質(zhì)DA神經(jīng)元丟失以及隨后發(fā)生的DA-Ach濃度比例失衡，黑質(zhì)DA神經(jīng)元緩慢丟失到超過(guò)50%才出現(xiàn)臨床癥狀。同等條件下采用6-OHDA腦立體定向注射制作的PD模型成功，出現(xiàn)行為學(xué)改變時(shí)間為2 w，這已在大量相關(guān)模型試驗(yàn)研究中得到很好地印證〔2〕。本研究證實(shí)了PD紋狀體區(qū)DA/Ach這一對(duì)遞質(zhì)的平衡失常不僅僅是由于DA的降低所致，Ach的上調(diào)更加重了這種失衡。隨著病情的進(jìn)展，DA神經(jīng)元進(jìn)一步減少，對(duì)Ach的拮抗作用大大降低，這時(shí)紋狀體內(nèi)Ach的含量絕對(duì)升高，進(jìn)而產(chǎn)生M型ACh受體興奮時(shí)的肌肉震顫，肌張力增加等臨床癥狀〔3〕從行為學(xué)上觀察我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PD模型制作的大鼠，給予阿樸嗎啡腹腔注射，5～10 min后可觀察到大鼠有嗅探，閉眼，僵直，肌震顫，不久開(kāi)始出現(xiàn)向注射對(duì)側(cè)旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)時(shí)大鼠身體向左側(cè)曲成環(huán)狀，首尾相接，以左后肢為支點(diǎn)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥7 r/min為成功模型。正常對(duì)照組未出現(xiàn)任何行為學(xué)變化，從1～21 d，B、C、D組隨著紋狀體Ach含量的增加，大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)也從7 d的4 r/min猛增到21 d的313 r/min。

隨著研究深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)選擇性Ach受體拮抗劑毒副作用明顯低于目前使用的抗膽堿藥物〔3，4〕，且迄今為止這方面的認(rèn)識(shí)很少，有廣闊的研究?jī)r(jià)值和臨床應(yīng)用前景。

1 Lacroix LP，Ceolin L，Zocchi A.Selective dopamine D(3)receptor antagonists enhance cortical acetylcholine levels measured with high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry without anti-cholinesterases〔J〕.J NeurosciMethods，2006;157(1)：25-31.

2 Tian Q，Lin ZQ，Wang XC，et al.Injection of okadaic acid into the meynert nucleus basalis of rat brain induces decreased acetylcholine level and spatial memory deficit〔J〕.Neuroscience，2006;126：277.

3 Arruda Paes PC，de Magalhaes L，Camillo MA，et al.Ionotropic glutamate receptors regulating labeled acetylcholine release from rat striatal tissue in vitro：possible involvement of receptor modulation in magnesium sensitivity〔J〕.Neurosci Res，2004;49(3)：289-95.

4 Quarta D，Ciruela F，Patkar K.Heteromeric nicotinic acetylcholine-dopamine autoreceptor complexes modulate striatal dopamine release〔J〕.Neuropsychopharmacology，2006;170(1)：148-55.