重組溶血素蛋白用于單增李斯特菌快速檢測的效果

郭宏華 劉 娟 劉百歌 張曉靜 晁 陽 何成彥 張學英

(吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春 130033)

單增李斯特菌是李斯特菌屬中致病性最強的，是人類最重要的食源性病原菌〔1〕，也是引起人類和動物李斯特菌病的主要致病菌，可造成多種動物如豬、雞等畜禽死亡，人感染后可造成腦膜炎、新生兒敗血癥、早產、死胎、膿腫、心內膜炎、單核細胞增多等疾病，死亡率很高，可高達30% ～40%〔2〕。近年來在世界上很多國家也報道了由于污染單增李斯特菌而發生的食物中毒事件〔3〕。因此，建立LM的快速檢測方法，對人類健康和食品生產具有重要意義和應用前景。目前單增李斯特菌的檢測主要依靠傳統的分離培養和生化鑒定，需要的時間長，檢出率較低〔4〕;其他檢測方法如PCR方法、基因探針等都存在特異性不足〔5〕。本實驗擬改進該菌的檢測方法，進一步提高檢測的特異性、靈敏度、重現性及穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料 單增李斯特菌標準菌種(54001、54002株)購于北京鼎國生物制劑公司，實驗室低溫保存;小鼠骨髓瘤NS-1細胞，吉林大學中日聯誼醫院實驗室保存，BALB/C小鼠由吉林大學醫學部動物室提供。RPMI 1640、胎牛血清(GIBCO)，HAT、HT、PEG 4000(SIGMA)均購于大連寶生物制劑公司。抗體亞類測定試劑盒為SIGMA公司產品。

1.2 方法

1.2.1 單增李斯特菌體表面抗原的提取 細菌接種于TSBYE培養基中培養16～18 h后，10 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS洗3次后，將菌體懸浮于SDS緩沖液中，在常溫下孵育1 h，10 000 r/min離心10 min，收集上清提取液，去離子水透析48 h，在595 nm處比色，得吸光度，查標準曲線，得到蛋白濃度，－80℃凍存。

1.2.2 動物免疫方案 將收集培養的李斯特菌溶于生理鹽水中，經甲醛固定，PBS洗6次，保存于－20℃備用。取1×108溶于100 μl PBS中初次免疫小鼠，腹腔注射。1個月后進行第二次免疫，菌體量同初次免疫;融合前3 d加強免疫，劑量減為原來的一半。

1.2.3 細胞融合

1.2.3.1 培養骨髓瘤細胞NS-1 融合前骨髓瘤細胞用8-AG培養基篩選其活性。骨髓瘤細胞培養于RPMI 1640培養液中，細胞在指數增長期狀態下進行融合。

1.2.3.2 制備飼養細胞 將小鼠拉頸處死，用75%酒精浸泡3～4 min。用手術剪將小鼠腹部剪開一小口，剝開皮膚，露出腹腔，用酒精棉消毒，用無菌注射器注入5～6 ml預冷的培養液，反復沖洗，吸出沖洗液。沖洗液放入離心管中離心5～6 min，用20%小牛血清培養液混懸，將細胞數調整至1×105/ml，將細胞液接種于96孔板中。置37℃條件下培養。

1.2.3.3 脾細胞的制備 免疫過的血清抗體滴度高的Balb/c鼠，拉頸處死。將小鼠放在75%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在無菌條件下取脾，用血清培養液沖洗2次。把脾臟移入盛有無血清培養液的勻漿器中研磨，用無血清培養液沖洗，做成脾細胞懸液，用毛細管將懸液移入小試管中離心，去上清，懸浮于不完全培養液中，計數細胞量。

1.2.3.4 細胞融合 取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞按10∶1比例混合，在 50 ml離心管中用不完全培養液洗1次后經1 000 r/min離心7 min，棄上清，吸凈殘留液體，輕彈離心管底使沉淀的細胞團塊略松動，同時加入50%PEG 1 ml，1 min內加完。加預熱的不完全培養液，停止PEG的作用。每隔2 min，勻速加入1 ml，直至加到10 ml，輕輕混勻，1 000 r/min離心6 min。去掉離心后融合細胞的上清液，用10%小牛血清培養液輕輕混懸，將融合細胞混合懸液加入到含有飼養細胞的96孔板中，100 μl/孔，37℃，5%CO2孵箱培養。

1.2.4 ELISA法進行雜交瘤細胞的篩選培養 脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理后形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。雜交瘤細胞在HAT選擇培養液中可以生長繁殖。前幾天用HAT培養液培養融合細胞，第8天后每天半量換HAT培養液，維持10 d后換一般培養液。當細胞鋪滿管底1/5時，開始檢測特異性抗體，用ELISA篩選出陽性克隆。

篩選方法：將每孔100 μl細胞培養液加入到細菌表面抗原包被好的酶標板上，同時以免疫小鼠血清為陽性對照(1∶1 000稀釋)、正常小鼠血清為陰性對照(1∶1 000稀釋)，每孔100 μl，37℃孵育1 h，PBS洗3次，加入 HRP酶標記的兔抗鼠 IgG 100 μl，室溫孵育1 h;棄酶標二抗，PBS洗4次;加底物顯色劑50 ml/孔，室溫避光反應30 min;每孔加入2 mol/L H2SO4終止反應;酶標儀OD450 nm處測定，測定值高于陰性對照3倍以上者為陽性。

1.2.5 陽性雜交瘤細胞的克隆化培養 經兩次檢測均為陽性的雜交瘤細胞，采用有限稀釋法進行亞克隆化。克隆前1 d制備飼養細胞層(同細胞融合)，將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹干，計數。調整細胞為3～10個細胞/ml。取前一日準備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100 μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。在第7天換液，以后每2～3 d換液1次。8～9 d可見細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養。每個克隆盡快凍存。

1.2.6 單克隆抗體的大量生產 取健康BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5 ml高壓滅菌的液體石蠟，10 d后往小鼠腹腔注射雜交瘤細胞。接種細胞10 d待小鼠腹部變大、瀕臨死亡時收集腹水至離心管中，1 500 r/min，離心10 min，吸取上清，去掉脂肪層分裝后貯存于－20℃冰箱，進一步純化。

1.2.7 單克隆抗體的純化 收集到的小鼠腹水用飽和硫酸銨溶液滴加至溶液濃度為33%，過夜，離心，去上清，PBS透析除鹽。

1.2.8 單克隆抗體類和亞類的鑒定 離心處理樣品，用PBS按照1∶1 000比例稀釋腹水樣品和陰性對照品。取100 μl分別包被到ELISA板中，每種樣品一列，每列6個孔，取PBS為空白對照，酶標板置于室溫1 h。用PBST洗板3次，分別加入同型試劑 IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3(Sigma公司生產)，將每種亞型抗體分別加入到空白孔、陰性對照和腹水樣品孔中，每孔100 μl，室溫放置30 min。PBST洗板3次，每孔加入1∶500稀釋的HRP標記的馬抗羊二抗(北京鼎國生物技術責任公司)，每孔100 μl，室溫放置15 min。PBST 洗板3 次，每孔加入底物液 100 μl，放置 10 min 后加 50 μl終止液，用酶標儀在490 nm處讀數記錄。

1.2.9 雜交瘤細胞的核型分析 取處于對數生長期的雜交瘤細胞，加入秋水仙素到培養液中，使其終濃度為0.5 μg/ml，在培養箱中繼續培養4～6 h。收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，將37℃預溫0.075 mol/L的KCL溶液加入，放置培養箱中靜置20～30 min。往細胞懸液中加入新鮮配制的醋酸-甲醇固定液1 ml，用吸管輕輕吹打，1 000 r/min離心5 min。把上清液棄去，緩慢加入新鮮固定液5 ml，用吸管輕輕吹打，靜置20～30 min，1 000 r/min離心5 min，吸出大部分上清，留1 ml左右。取2～3滴細胞懸液，從較高處距離向預冷的載玻片滴加，在室溫中自然干燥。常規Giemsa染色，鏡下計數染色體。

2 結果

2.1 抗單核李斯特菌單克隆抗體特異性的鑒定 共進行10次細胞融合，融合率為32%(1 065/3 360)。通過初篩，與單增李斯特菌呈強陽性反應、大腸埃希菌呈陰性反應孔為193孔。進一步鑒定此193個樣品與下表所列菌種的反應性，篩選出與其無交叉反應的產抗單核李斯特菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為2F5、5H1 和8F9。

2.2 雜交瘤細胞的核型 篩選出的產抗單核李斯特菌單克隆抗體的細胞系2F5、5H1和8F9，經常染色體染色可見染色體數顯著增加，為雜交瘤細胞。見圖1。

圖1 雜交瘤細胞核型

2.3 單克隆抗體類與亞類 經間接ELISA方法測定，2F5、5H1和8F9單克隆抗體類型分別為IgG2b、IgG3、IgM，檢測樣品OD490值分別為 0.742、1.072、2.064。

3 討論

李斯特菌在上世紀90年代被列為4大重要的致病菌之一〔6〕。WHO食品安全工作計劃已將單增李斯特菌列為重點監測的食源性病菌之一〔7，8〕。目前，檢測單增李斯特菌傳統的方法是分離培養和生化鑒定，檢測時間長，靈敏度不高，不利于疾病的預防和控制。所以，為了改進單增李斯特菌的檢測方法，建立對該菌快速檢測是很必要的。

本研究利用產單核李斯特菌菌體蛋白免疫動物Balb/c小鼠，多次反復經背部皮下多點注射，每次注射應定量，并注重接種的時間間隔，適當添加弗氏佐劑。經過一段時間的飼養后，選擇血清抗體滴度高的接種動物，在無菌情況下處死，取出脾臟剪碎、分離、離心取其懸浮細胞置入培養皿中，備用。再另取純系小鼠的骨髓瘤細胞放進培養皿中，加入一些飼養細胞(如巨噬細胞)促使其生長，在該混合液中有多種細胞。經過細胞融合實驗，提取目的細胞——雜交瘤細胞，進行HAT選擇培養獲得純代雜交瘤細胞。在眾多的雜交瘤細胞中，有的不表達免疫球蛋白，有的表達其他類型的球蛋白。因此，要用特異性的檢測方法——酶聯免疫吸附試驗(ELISA)從眾多的細胞中篩選出陽性雜交瘤細胞。有限稀釋法將目的雜交瘤細胞分離成單個細胞，讓其克隆化形成細胞株，再轉移至其他培養基中擴大培養。為了大量地獲得抗體，還需要經過小鼠腹腔接種，誘導小鼠腹水，然后從腹水中分離提純抗體。從小鼠腹水中獲取的單克隆抗體，通過親和層析方法進行純化，可獲得純化的單克隆抗體，該抗體純度較好、效價較高。與過去傳統的方法比較，提高了實驗方法的靈敏性、準確性、特異性和標準化。

單克隆抗體只與抗原分子上某一個表位(即抗原決定簇)相結合，利用這一特性可把它作為研究工作中的探針，可以從分子、細胞和器官的不同水平上，研究抗原物質的結構與功能的關系，并可從理論上闡明其機制。如用熒光物質標記單抗作為探針，能方便地確定與其結合的相應生物大分子(蛋白質、核酸、酶等)在細胞中的位置和分布。本研究旨在研制抗單增李斯特菌單克隆抗體，為今后進一步檢測單克隆抗體奠定基礎。

1 Yundong Chi-Zhang，Kit L Yam.Effective control of Listeriamonocytogenes by combination of nisin formulated and slowly released into a broth system〔J〕.Intern J Food Microbiol，2004;90：15-22.

2 熊國華，于 莉，曹際娟，等.單增李斯特菌免疫膠體金試紙條快速檢測〔J〕. 中國公共衛生雜志，2008;24(2)：248-9.

3 王海燕，劉中學，劉 虹，等.視頻中單增李斯特菌快速、敏感、特異PCR檢測方法的建立〔J〕.檢驗檢疫學刊，2006;(1)：3-6.

4 吳清平，李善志，張菊梅，等.單核細胞增生李斯特菌檢測技術研究進展〔J〕.中國衛生檢驗雜志，2005;15(7)：888-90.

5 Becker B，Jordan S，Holzapf WH，et al.Rapid and specific detection of Listeria monocytogenes in smoked salmon with BAX2 PCR〔J〕.Food Cont rol，2005;16(8)：7172721.

6 陳道利，陶 勇，霍開蘭，等.直接入口食品中單核細胞李斯特菌污染調查及其檢驗方法比較〔J〕.中國衛生檢驗雜志，2003;8(4)：492-3.

7 李干紅，丁曉雯.李斯特菌及其快速檢測〔J〕.廣州食品工業科技，2002;18(3)：67-9.

8 周曉輝，焦新安.產單核細胞李斯特菌的分子鑒定與亞分型研究〔J〕. 中國人獸共患病雜志，2003;19(5)：44-7.