氧化蘇木素誘導(dǎo)人乳癌MCF-7細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制

王 利

咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧 437100

氧化蘇木素誘導(dǎo)人乳癌MCF-7細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制

王 利

咸寧學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北咸寧 437100

目的 對(duì)氧化蘇木素誘導(dǎo)人乳癌MCF-7細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制進(jìn)行研究。方法 培養(yǎng)人乳癌細(xì)胞株MCF-7與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A，MCF-7細(xì)胞采用不同濃度的氧化蘇木素處理48h后，采集細(xì)胞。結(jié)果 氧化蘇木素對(duì)MCF-7細(xì)胞有高效的細(xì)胞毒作用，對(duì)MCF 10A細(xì)胞細(xì)胞毒作用較弱。MCF-7細(xì)胞凋亡率隨著氧化蘇木素含量增加而升高。細(xì)胞內(nèi)DiOC6熒光強(qiáng)度隨著氧化蘇木素含量增加而降低。氧化蘇木素能劑量依賴性的使survivin蛋白的表達(dá)降低。 結(jié)論 氧化蘇木素能誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是survivin蛋白的表達(dá)降低。

氧化蘇木素；人乳癌MCF-7；細(xì)胞凋亡

乳腺癌是女性常見腫瘤疾病，嚴(yán)重危害女性的身體健康，目前，治療乳癌有很大改觀，但仍有一定局限性，所以尋找新的治療方法是當(dāng)今研究目標(biāo)。筆者采用具有縮血管、中樞神經(jīng)細(xì)胞的缺血保護(hù)及抗炎功效的氧化蘇木素，觀察人乳癌MCF-7細(xì)胞，研究其是否有抗腫瘤活性及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

四氮唑藍(lán)MTT、DiOC、鏈霉素及青霉素（上?；瘜W(xué)試劑廠），DMEM培養(yǎng)基、超級(jí)新生小牛血清（天津?yàn)笊锛夹g(shù)有限公司），DMSO （Gibeo公司），AnnexinV/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞色素C、caspase-9、survivin及GAPDH抗體(南京凱基生物公司)。3550自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、FC500流式細(xì)胞儀均為美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品。

1.2 方法

在37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2下將人乳癌細(xì)胞株 MCF-7與正常乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A在10%小牛牛血清與青鏈霉素（100U/mL和100μg/mL）的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。MCF-7細(xì)胞采用不同濃度的氧化蘇木素處理48h后，采集細(xì)胞，按照試劑盒說明于PBS緩沖液中對(duì)每個(gè)樣品10000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，凋亡細(xì)胞為AnnexinV與PI雙陽性、AnnexinV陽性的細(xì)胞。檢測(cè)線粒體膜電位高低。1×SDS上樣緩沖液裂解細(xì)胞提取總蛋白，內(nèi)參照顯示相同的上樣量為GAPDH蛋白。對(duì)細(xì)胞漿中細(xì)胞色素C進(jìn)行采集，將GAPDH蛋白作為細(xì)胞漿蛋白的內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采t檢驗(yàn)，計(jì)量型數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05，為有顯著差異性，提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

①M(fèi)TT結(jié)果顯示，氧化蘇木素對(duì)MCF-7細(xì)胞有高效的細(xì)胞毒作用，對(duì)MCF 10A細(xì)胞細(xì)胞毒作用較弱，兩組比較，P＜0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳情見表1。采用AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)不同含量氧化蘇木素對(duì)MCF-7細(xì)胞的影響，MCF-7細(xì)胞處理48h后，細(xì)胞凋亡率見表2。MCF-7細(xì)胞凋亡率隨著氧化蘇木素含量增加而升高。

表1 氧化蘇木素對(duì)兩種細(xì)胞作用結(jié)果（±s）

表1 氧化蘇木素對(duì)兩種細(xì)胞作用結(jié)果（±s）

組別 IC50（μmol/L）MCF-7細(xì)胞MCF 10A細(xì)胞7.23±0.65 33.86±2.97

表2 不同含量氧化蘇木素對(duì)MCF-7細(xì)胞影響（±s）

表2 不同含量氧化蘇木素對(duì)MCF-7細(xì)胞影響（±s）

氧化蘇木素（μmol/L） MCF-7細(xì)胞凋亡率（%）0 7.5 15 30 3.42±0.68 17.23±1.33 31.58±4.45 51.56±5.79

②采用DiOC6檢測(cè)氧化蘇木素檢測(cè)對(duì)線粒體膜電位的影響，0、7.5、15、30μmol/L 氧化蘇木素處理細(xì)胞 48h 后，細(xì)胞內(nèi)DiOC6 熒光強(qiáng)度分別為（11.62±0.61）、（9.86±0.70）、（8.53±0.65）、（8.05±0.45）。

③氧化蘇木素對(duì)細(xì)胞處理48h后，細(xì)胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C有劑量依賴性提高趨勢(shì)，caspase-9裂解帶出現(xiàn)在蛋白免疫印跡檢測(cè)中，說明釋放進(jìn)細(xì)胞漿內(nèi)的細(xì)胞色素C剪切下游的caspase-9，激活的caspase-9可造成線粒體通路凋亡。

④氧化蘇木素能劑量依賴性的使survivin蛋白的表達(dá)降低。

3 討論

目前，抗乳腺癌藥物有很多種，但是腫瘤多藥、耐藥的產(chǎn)生對(duì)治療產(chǎn)生很大影響，大多數(shù)藥物還有較嚴(yán)重的副作用，所以新的抗癌藥物研發(fā)是治療乳腺癌的有效途徑[2]。本研究是對(duì)蘇木提取物中分離的一個(gè)單體成分氧化蘇木素進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，氧化蘇木素有較高效的抗腫瘤活性。氧化蘇木素對(duì)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用明顯高于其對(duì)MCF 10A細(xì)胞細(xì)胞毒作用，兩組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），所以需對(duì)氧化蘇木素抗人乳癌細(xì)胞作用機(jī)制進(jìn)行更深一步探討。AnnexinV/PI雙染法凋亡檢測(cè)是一種具有高特異性及強(qiáng)敏感性的檢測(cè)方法，細(xì)胞凋亡初期細(xì)胞膜內(nèi)的磷脂酰絲氨酸可外翻到細(xì)胞外與對(duì)其有高度親和力的蛋白AnnexinV結(jié)合，AnnexinV單陽性的細(xì)胞出現(xiàn)，在細(xì)胞膜嚴(yán)重破損的細(xì)胞凋亡晚期，PI可進(jìn)入細(xì)胞里，AnnexinV與PI雙陽性細(xì)胞出現(xiàn)。線粒體途徑與死亡受體途徑是細(xì)胞凋亡的主要通路。

綜上所訴，氧化蘇木素能通過線粒體通路誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，氧化蘇木素可劑量依賴性下調(diào)survivin蛋白的表達(dá)，下調(diào)survivin可能是其誘發(fā)線粒體凋亡通路的主要機(jī)制。

[1]佟俊杰,張廣耘,袁曉.胞凋亡檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].口腔醫(yī)學(xué),2010(7)：59-61.

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A

1672-5654（2012）07（b）-0163-01

2012-06-19)