氧化蘇木素誘導人乳癌MCF-7細胞凋亡及其作用機制

王 利

咸寧學院基礎醫學院，湖北咸寧 437100

氧化蘇木素誘導人乳癌MCF-7細胞凋亡及其作用機制

王 利

咸寧學院基礎醫學院，湖北咸寧 437100

目的 對氧化蘇木素誘導人乳癌MCF-7細胞凋亡及其作用機制進行研究。方法 培養人乳癌細胞株MCF-7與正常乳腺上皮細胞MCF 10A，MCF-7細胞采用不同濃度的氧化蘇木素處理48h后，采集細胞。結果 氧化蘇木素對MCF-7細胞有高效的細胞毒作用，對MCF 10A細胞細胞毒作用較弱。MCF-7細胞凋亡率隨著氧化蘇木素含量增加而升高。細胞內DiOC6熒光強度隨著氧化蘇木素含量增加而降低。氧化蘇木素能劑量依賴性的使survivin蛋白的表達降低。 結論 氧化蘇木素能誘導MCF-7細胞凋亡，其作用機制可能是survivin蛋白的表達降低。

氧化蘇木素；人乳癌MCF-7；細胞凋亡

乳腺癌是女性常見腫瘤疾病，嚴重危害女性的身體健康，目前，治療乳癌有很大改觀，但仍有一定局限性，所以尋找新的治療方法是當今研究目標。筆者采用具有縮血管、中樞神經細胞的缺血保護及抗炎功效的氧化蘇木素，觀察人乳癌MCF-7細胞，研究其是否有抗腫瘤活性及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

四氮唑藍MTT、DiOC、鏈霉素及青霉素（上海化學試劑廠），DMEM培養基、超級新生小牛血清（天津灝洋生物技術有限公司），DMSO （Gibeo公司），AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒、細胞色素C、caspase-9、survivin及GAPDH抗體(南京凱基生物公司)。3550自動酶聯免疫檢測儀、FC500流式細胞儀均為美國Beckman公司產品。

1.2 方法

在37℃體積分數5%CO2下將人乳癌細胞株 MCF-7與正常乳腺上皮細胞MCF 10A在10%小牛牛血清與青鏈霉素（100U/mL和100μg/mL）的DMEM培養液中進行培養。MCF-7細胞采用不同濃度的氧化蘇木素處理48h后，采集細胞，按照試劑盒說明于PBS緩沖液中對每個樣品10000個細胞進行檢測，凋亡細胞為AnnexinV與PI雙陽性、AnnexinV陽性的細胞。檢測線粒體膜電位高低。1×SDS上樣緩沖液裂解細胞提取總蛋白，內參照顯示相同的上樣量為GAPDH蛋白。對細胞漿中細胞色素C進行采集，將GAPDH蛋白作為細胞漿蛋白的內參照。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計學處理，計數資料采t檢驗，計量型數據采用均數±標準差（±s）檢驗，計量資料采用χ2檢驗，以P＜0.05，為有顯著差異性，提示有統計學意義。

2 結果

①MTT結果顯示，氧化蘇木素對MCF-7細胞有高效的細胞毒作用，對MCF 10A細胞細胞毒作用較弱，兩組比較，P＜0.05，差別有統計學意義，詳情見表1。采用AnnexinV/PI雙染法檢測不同含量氧化蘇木素對MCF-7細胞的影響，MCF-7細胞處理48h后，細胞凋亡率見表2。MCF-7細胞凋亡率隨著氧化蘇木素含量增加而升高。

表1 氧化蘇木素對兩種細胞作用結果（±s）

表1 氧化蘇木素對兩種細胞作用結果（±s）

組別 IC50（μmol/L）MCF-7細胞MCF 10A細胞7.23±0.65 33.86±2.97

表2 不同含量氧化蘇木素對MCF-7細胞影響（±s）

表2 不同含量氧化蘇木素對MCF-7細胞影響（±s）

氧化蘇木素（μmol/L） MCF-7細胞凋亡率（%）0 7.5 15 30 3.42±0.68 17.23±1.33 31.58±4.45 51.56±5.79

②采用DiOC6檢測氧化蘇木素檢測對線粒體膜電位的影響，0、7.5、15、30μmol/L 氧化蘇木素處理細胞 48h 后，細胞內DiOC6 熒光強度分別為（11.62±0.61）、（9.86±0.70）、（8.53±0.65）、（8.05±0.45）。

③氧化蘇木素對細胞處理48h后，細胞漿內細胞色素C有劑量依賴性提高趨勢，caspase-9裂解帶出現在蛋白免疫印跡檢測中，說明釋放進細胞漿內的細胞色素C剪切下游的caspase-9，激活的caspase-9可造成線粒體通路凋亡。

④氧化蘇木素能劑量依賴性的使survivin蛋白的表達降低。

3 討論

目前，抗乳腺癌藥物有很多種，但是腫瘤多藥、耐藥的產生對治療產生很大影響，大多數藥物還有較嚴重的副作用，所以新的抗癌藥物研發是治療乳腺癌的有效途徑[2]。本研究是對蘇木提取物中分離的一個單體成分氧化蘇木素進行研究，結果顯示，氧化蘇木素有較高效的抗腫瘤活性。氧化蘇木素對MCF-7細胞的細胞毒作用明顯高于其對MCF 10A細胞細胞毒作用，兩組比較，差別有統計學意義（P＜0.05），所以需對氧化蘇木素抗人乳癌細胞作用機制進行更深一步探討。AnnexinV/PI雙染法凋亡檢測是一種具有高特異性及強敏感性的檢測方法，細胞凋亡初期細胞膜內的磷脂酰絲氨酸可外翻到細胞外與對其有高度親和力的蛋白AnnexinV結合，AnnexinV單陽性的細胞出現，在細胞膜嚴重破損的細胞凋亡晚期，PI可進入細胞里，AnnexinV與PI雙陽性細胞出現。線粒體途徑與死亡受體途徑是細胞凋亡的主要通路。

綜上所訴，氧化蘇木素能通過線粒體通路誘導MCF-7細胞凋亡，氧化蘇木素可劑量依賴性下調survivin蛋白的表達，下調survivin可能是其誘發線粒體凋亡通路的主要機制。

[1]佟俊杰,張廣耘,袁曉.胞凋亡檢測方法的研究進展[J].口腔醫學,2010(7)：59-61.

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1672-5654（2012）07（b）-0163-01

2012-06-19)