紅霉素原料藥微生物限度檢查法探索及方法驗證

陳萬勝

紅霉素原料藥是大環內酯類抗菌藥物，本身有抑菌作用，影響微生物的生長。建立藥品微生物限度檢查法時，應進行細菌、霉菌及酵母菌計數方法的驗證和控制菌檢查方法的驗證，以確認所采用的方法是否適合于該藥品的細菌、霉菌及酵母菌的測定和控制菌檢查。若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時，計數方法和檢查方法應重新驗證[1]。

1 材料與方法[2]

1.1 一般材料

1.1.1 藥品 霉素原料藥，批號:201109001、201109002、201109003三個批次生產單位:安陽九州藥業有限公司。

1.1.2 培養基及稀釋劑 營養瓊脂培養基、改良馬丁瓊脂培養、營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液均為北京三藥科技開發公司生產。

1.1.3 驗證試驗用菌種 金黃色葡萄球菌CMCC(B)26 003、枯草芽孢桿菌 CMCC(B)63 501、大埃希菌CMCC(B)44 102、白色念珠菌CMCC(F)98 001、曲霉 CMCC(F)98 003均為3代，從河南省食品藥品檢驗所購進。

1.1.4 主要儀器 NSO1-3型集菌器;PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養箱;L-5霉菌培養箱;htysteritest601集菌儀。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備

1.2.1.1 細菌菌液的制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養瓊脂上，30℃ ～35℃培養18～24 h。取此培養物用0.9%的無菌氯化鈉溶液分別采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4～10-6，制成每1 ml含菌數為50～100 cfu的菌懸液，作活菌計數用。

1.2.1.2 霉菌菌液的制備 接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基中，23℃ ～28℃培養24～48 h。取此培養物用0.9%的無菌氯化鈉溶液分別采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4～10-6，制成每1 ml含菌數為50～100 cfu的菌懸液;接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基中，23℃ ～28℃培養5～7 d。取此培養物加3～5 ml含0.5%聚山梨酯80的0.9%的無菌氯化鈉溶液分別采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4～10-6，制成每1 ml含孢子數為50～100 cfu的孢子懸液，作活菌計數用。

上述菌懸液保存在冰箱內，2～8℃保存，在24 h內使用。

1.2.2 供試藥液的制備

1.2.2.1 稱取紅霉素10 g溶于100 ml無菌pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，作為1∶10的供試藥液。

1.2.2.2 稱取紅霉素10 g加入含10 g吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，充分振搖使溶解，作為1∶10的供試液。

1.2.2.3 稱取紅霉素10 g加入含10 g吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至2000 ml，充分振搖使溶解，作為1∶200的供試液。

1.2.3 細菌計數方法及驗證試驗方法

1.2.3.1 實驗方法 中國藥典2010年版二部附錄微生物限度檢查法中的平皿稀釋法和薄膜過濾法。

1.2.3.2 回收率測定 ①試驗組:分別取以上3種供試藥液1 ml于5個營養瓊脂平皿中;同時分別取以上3種供試藥液10、10、200 ml以無菌操作加入裝有直徑50 mm、孔徑不大于0.45 μm微孔濾膜的過濾器內，減壓抽干后，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗7次，每次100 ml，最后一次加入1 ml金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌菌液，過濾后，取出濾膜，菌面朝上貼于凝固的營養瓊脂平板上，于30℃～35℃培養3 d，逐日觀察，計數。②菌液組:測定每一菌株的試驗菌數，采用平板菌落計數法。③供試藥品對照組:不加菌液，其他操作同試驗組，測定樣品本底菌數。④稀釋劑對照組:分別取無菌pH值7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液與含10 g吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，按照試驗組的方法，逐一加入試驗菌液1 ml，其他操作同試驗組。

1.2.3.3 回收率計算公式 試驗組的菌回收率%=(試驗組菌落數均值-供試品對照組菌落數均值)/菌液組菌落數均值×100%。

稀釋劑對照組回收率%=稀釋劑對照組菌落數均值/菌液組菌落數均值×100%。

1.2.4 霉菌和酵母菌計數方法及驗證試驗方法

1.2.4.1 實驗方法 中國藥典2010年版二部附錄微生物限度檢查法中的平皿法和薄膜過濾法。

1.2.4.2 回收率測定 ①試驗組:分別取以上三種供試藥液1 ml于5個玫瑰紅鈉瓊脂平皿中，同時分別取以上三種供試藥液10、10、200 ml以無菌操作加入裝有直徑50 mm、孔徑不大于0.45 μm微孔濾膜的過濾器內，減壓抽干后，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗7次，每次100 ml，最后一次加入1 ml白色念珠菌、黑曲霉菌菌液，，過濾后，取出濾膜，菌面朝上貼于凝固的玫瑰紅鈉瓊脂平板上，于23℃ ～28℃培養，培養5 d，逐日觀察，計數。②菌液組:測定每一菌株的試驗菌數，采用平板菌落計數法。③供試藥品對照組:不加菌液，其他操作同試驗組，測定樣品本底菌數。④稀釋劑對照組:分別取無菌pH值7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液與含10 g吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，按照試驗組的方法，逐一加入試驗菌液1 ml，其他操作同試驗組。

1.2.4.3 回收率計算公式 同細菌:①供試品試驗組、供試品對照組均無菌生長，菌液組、稀釋劑對照組菌落生長良好。②供試品試驗組、供試品對照組、菌液組、稀釋劑對照組菌落生長情況如表1。③供試品試驗組、供試品對照組、菌液組、稀釋劑對照組菌落生長情況如表2。

表1

表2

1.2.5 控制菌檢查方法及驗證

1.2.5.1 實驗方法 中國藥典2010年版二部附錄微生物限度檢查法中的平皿法和薄膜過濾法。

1.2.5.2 菌液制備 取經37℃培養18～24 h大腸埃希菌的營養肉湯培養物1 ml加9 ml滅菌生理鹽水，10倍稀釋至10-6，細菌數約為 10 ～100 cfu/ml。

1.2.5.3 控制菌驗證 試驗組:分別取三種供試藥液10 ml以無菌操作加入100 ml膽鹽乳糖培養基中培養;同時分別取以上三種供試藥液10 ml、10 ml、200 ml以無菌操作加入裝有直徑50 mm、孔徑不大于0.45 μm微孔濾膜的過濾器內，減壓抽干后，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗7次，每次100 ml，最后一次加入1 ml大腸埃希菌液，過濾后，取出濾膜，加入100 ml膽鹽乳糖培養基中培養，35℃ ～37℃培養24 h。

1.2.6 觀察結果 ①供試品試驗組均無菌生長。②供試品試驗組均無菌生長。③供試品試驗組菌落生長情況見表3。

表3

2 結果

2.1 結果可知:①制備的供試液由于沒有完全溶解，沒有消除藥品本身的抑菌作用，不能用于細菌限度的測定。②制備的供試液雖然完全溶解，但供試液濃度過高，藥物的抑菌作用仍沒有完全消除。③制備的供試液平皿稀釋法金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率低于70%，不符合驗證的要求，薄膜過濾法沖洗量為700 ml時，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌的回收率均高于70%，符合驗證規定的要求。

2.2 從2.6結果可知:控制菌(大腸埃希菌)，采用薄膜過濾法檢查大，沖洗量為700 ml，結果符合驗證規定要求。

3 討論

3.1 從上述結果可知，紅霉素原料藥的微生物限度檢查可依據中國藥典2010年版二部附錄微生物限度檢查法中的薄膜過濾法進行，即取本品10 g加入含10 g吐溫80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至2000 ml，充分振搖使溶解，作為1∶200的供試液，取供試液200 ml以無菌操作加入裝有直徑50 mm、孔徑不大于0.45 μm微孔濾膜的過濾器內，減壓抽干后，用 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗7次，每次100 ml。

3.2 紅霉素原料本身具有抑菌作用，制備供試藥液的方法會影響微生物的生長，做微生物限度檢查法的驗證試驗證明，必須消除藥品中抑菌物質的干擾，才能得到準確的測定結果。

3.3 由以上驗證實驗證明，做微生物限度檢查法的驗證是很有必要的，若不做驗證實驗，所做的實驗結果就不一定準確、可靠。

3.4 一個藥品要做微生物限度檢查時，應該怎樣去操作，什么方法才最適合個品種，是常規平皿法還是薄膜過濾法等，是要根據藥品的性質選用你認為適宜的一個方法或幾個方法進行試驗來驗證你所選用的方法是否可行。只有這樣你的試驗才是科學的。

[1]中華人民共和國藥典2010年版二部藥典委員會.中國醫藥科技出版社附錄ⅪJ微生物限度檢查法:107.

[2]中國藥品檢驗標準操作規范2010年版.中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗總所.編寫.微生物限度檢查法:351.