Chk1/2蛋白在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的分布及意義

李勇 賴潤龍 譚殿輝 陳煜 雷霆

細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1，2(checkpoint kinase 1，2，即Chkl，Chk2)位于細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激活徑路的終端，是細(xì)胞周期檢測中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白激酶［1］。由于目前國內(nèi)外關(guān)于Chk1和Chk2在膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中實(shí)際表達(dá)狀況的報(bào)道很少，本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測Chk1、Chk2蛋白在不同膠質(zhì)瘤組織和正常對(duì)照組織中的分布特點(diǎn)，以探討Chk1、Chk2作為膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)的合理性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2005年5月至2011年8月我院病理科存檔處已確診腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本80例，其中男44例，女36例，年齡6～68歲，平均(39.7±8.4)歲。參照 WHO(2000年)膠質(zhì)瘤分類及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中髓母細(xì)胞瘤12例，室管膜瘤9例，少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤16例，星形細(xì)胞瘤43例(其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤12例);WHOⅠ～Ⅱ級(jí)46例，WHOⅢ～Ⅳ級(jí)34例。通過內(nèi)減壓手術(shù)獲得正常腦組織標(biāo)本18例作為對(duì)照，其中男11例，女7例，年齡18～54歲，平均(32.5±6.5)歲。所有患者術(shù)前均無放療、化療史。組織經(jīng)10% 福爾馬林液固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片，先經(jīng)HE染色，病理科醫(yī)師光鏡復(fù)查證實(shí)病理診斷后，再行免疫組化染色。

1.2 方法 所取組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片。采用免疫組織化學(xué)鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶法(Strept-avidin-biotin complex，SABC)染色，以磷酸鹽緩沖液，Phosphate balanced solution，PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。參照Consantine等［2］的標(biāo)準(zhǔn)，高倍鏡(400)下綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測定。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):不著色0分;黃色1分;棕黃色2分;黃褐色3分。陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽性細(xì)胞數(shù) ＜10%者0分;10% ～40%者1分;40% ～70%者2分;≥70%者3分。兩種評(píng)分相乘，結(jié)果記為免疫組化評(píng)分值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS for windows Ver.13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)、方差分析和Peason's相關(guān)分析。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Chk1、Chk2蛋白在各類型膠質(zhì)瘤和正常腦組織中均表達(dá)，陽性細(xì)胞表達(dá)定位在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，并以細(xì)胞核為主(見圖1 A～F)。Chk1廣泛表達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，棕黃色染色較強(qiáng)，而正常腦組織中染色普遍較弱。膠質(zhì)瘤細(xì)胞與正常腦組織相比，Chk1蛋白表達(dá)水平有顯著性差異(P=0.027)，Chk2蛋白表達(dá)水平經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無顯著性意義(P=0.173)。(見表1)。在髓母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及星形細(xì)胞瘤中，Chk1、Chk2蛋白表達(dá)無顯著性差異(P值分別為0.467、0.387)。在星形細(xì)胞瘤中，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與其他星形細(xì)胞瘤相比，Chk1、Chk2蛋白表達(dá)無顯著性差異(P值分別為0.274、0.312)。在高級(jí)別的膠質(zhì)瘤和低級(jí)別的膠質(zhì)瘤中，Chk1、Chk2蛋白表達(dá)水平無明顯差異(P值分別為0.301、0.135)。Chk1和Chk2蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.795，P＜0.001)(圖2)。(見表1)。

圖1 Chk1、Chk2蛋白在膠質(zhì)瘤中的陽性表達(dá)

3 討論

Sanchez［3］和 Matsuoka 等［4］首先闡述了人 Chk1 和 Chk2基因及其蛋白表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)Chk1和Chk2普遍存在于人多種組織細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中，而且在藥物及放射線照射引起的細(xì)胞周期阻滯反應(yīng)中，Chk1和Chk2發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，U87 mG神經(jīng)膠質(zhì)瘤［5］等多種腫瘤組織中均有其表達(dá)，并可能與某些腫瘤發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系。

Chk1、Chk2是ATM/ATR(ATM相關(guān)基因)的下游效應(yīng)基因，位于細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激活徑路的終端，通過調(diào)控Cdc25(A、B、C)、Wee1、P53 等效應(yīng)蛋白，激活 DNA 損傷檢測點(diǎn)［1］。在本研究中，通過免疫組織化學(xué)觀察不同膠質(zhì)瘤組織中Chk1、Chk2蛋白的分布發(fā)現(xiàn)，Chk1和 Chk2蛋白在所有類型的膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中均表達(dá)，陽性細(xì)胞表達(dá)定位在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，并以細(xì)胞核為主，這種分布可能與Chk1和Chk2能夠識(shí)別DNA損傷、參與一系列核內(nèi)磷酸化反應(yīng)的功能有關(guān)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Chk1蛋白表達(dá)水平明顯高于與正常腦組織，而Chk2在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達(dá)無明顯差別。這提示，從相對(duì)意義上而言，Chk1是一種腫瘤特異性表達(dá)蛋白，Chk1可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。由于Chk1在膠質(zhì)瘤中的顯著高表達(dá)，因此可以作為膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)，而Chk2在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用有待更進(jìn)一步 的研究。

表1 Chk1、Chk2蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

圖2 Chk1和Chk2蛋白在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的相關(guān)性(r=0.795，P ＜0.001)

放射治療是膠質(zhì)瘤綜合治療的重要手段之一，不同病理類型的膠質(zhì)瘤其放射敏感性亦不同，一般認(rèn)為由高到低依次為髓母細(xì)胞瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤、星形細(xì)胞瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［6］。本研究中，發(fā)現(xiàn)Chk1、Chk2蛋白的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病理類型無關(guān)，這提示，Chk1、Chk2蛋白的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的放射敏感性并無相關(guān)性，Chk1、Chk2蛋白表達(dá)水平不能作為膠質(zhì)瘤對(duì)放療抗拒的判定指標(biāo)。在病理分級(jí)上，Chk1、Chk2蛋白的表達(dá)水平在高級(jí)別的膠質(zhì)瘤和低級(jí)別的膠質(zhì)瘤中無明顯差異，可見Chk1、Chk2蛋白與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)無關(guān)。這說明Chk1、Chk2蛋白不能作為判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)。

Chk1和Chk2是目前被認(rèn)為在細(xì)胞周期檢測點(diǎn)中起重要作用的激酶，但對(duì)Chk1和Chk2在細(xì)胞周期檢測點(diǎn)中的作用有不同的認(rèn)識(shí)。Shigeishi［7］認(rèn)為Chk1和Chk2在胃癌中表達(dá)水平與P53蛋白表達(dá)水平有明顯相關(guān)性，但Chk1和Chk2之間表達(dá)無相關(guān)性。Chk1的抑制劑UCN-O1處理細(xì)胞后不僅增加P53表達(dá)的細(xì)胞對(duì)TMZ的敏感性，而且阻斷TMZ誘導(dǎo)的Chk1活化和短暫的G2/M阻滯，從而增加細(xì)胞凋亡［5］。在P53缺失的細(xì)胞中，抑制Chk1同樣可增加細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性［8］。這些提示Chk1可能參與腫瘤耐藥，但同樣的研究表明Chk2不能明顯增加腫瘤細(xì)胞的凋亡［9］。本研究中發(fā)現(xiàn)，Chk1與Chk2蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈正相關(guān)，這說明Chk1、Chk2蛋白在DNA損傷檢測點(diǎn)激活可能具有協(xié)同作用。

［1］Sanchez Y，Wong C，Thoma RS，et al.Conservation of the CHK1 checkpoint pathway in mammals:linkage of DNA damage to CDK regulation through Cdc25.Science，1997，277(5331):1497-1501.

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［3］Sanchez Y，Wong C，Thoma RS，et al.Conservation of the CHK1 checkpoint pathway in mammals:linkage of DNA damage to CDK regulation through Cdc25.Science，1997，277(5331):1497-1501.

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