難治性癲癇患者致癇灶中CX43的表達

張立志 馮俊強 陳晶 宋宏杉 陳業鵬

癲癇(epilepsy，EP)是神經系統常見疾病之一，目前仍以藥物治療為主，約有80%的患者經過系統的抗癲癇治療癥狀可緩解或治愈，但仍有20%左右對現有藥物治療無效，成為難治性癲癇［1］。癲癇的發病機制涉及諸多方面，其中神經元之間的聯絡在癲癇發作中也起重要作用。神經元之間最簡單的信息傳遞形式是電突觸，而縫隙連接(gap junction，GJ)是神經元電突觸的基本結構［2］，所以縫隙連接、縫隙連接蛋白(connexin，CX)與癲癇的關系倍受研究者的關注。目前針對GJ與癲癇的研究很多，但難治性癲癇患者致癇灶腦組織CX43的表達情況鮮有報道。本研究利用免疫組織化學方法觀察24例難治性癲癇患者手術切除的致癇灶腦組織及因腦外傷手術切除的正常腦組織中CX43的表達情況，并進行比較。進一步闡明CX43形成的縫隙連接在癲癇活動中的作用，為難治性癲癇的臨床研究及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 24例難治性癲癇手術患者中，男12例，女12 例，男女比例1∶1。年齡17 ～58 歲，平均(28.3±11.1)歲，近3個月發作頻率5～40次/月，平均(15.3±11.8)，患者病程2～29年，平均(8.3±7.8)。全部病例病史均在二年以上，經過兩種或兩種以上抗癲癇藥物系統治療，癲癇發作每個月4次以上，經影像學、頭皮長程腦電圖或顱內皮層腦電圖監測明確致癇灶，具有手術指征者。所有患者均在皮層電極監測下行致癇灶切除手術，切除病灶有額葉、顳葉、枕葉、海馬。術后病理證實為:腦組織皮質分層紊亂，神經元分布不均，膠質細胞增生。對照組腦外傷急診手術6例患者，女2例，男4例，男女比例2∶1。年齡17～55歲，平均(36.5 ±16.8)歲，均無癲癇發作及癲癇病史。

1.2 標本制作及腦組織中CX43表達的檢測 采集實驗組24例及對照組6例手術切除腦組織，切塊并分別置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液和2%～3%戊二醛中固定。①免疫組織化學法檢測(SP法):標本行石蠟包埋、切片、脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗3次，3 min/次。對組織抗原進行熱修復:pH6.0、0.01 mmol/L的檸檬酸抗原修復液中煮沸15 min。應用SP超敏試劑盒按照說明進行操作。應用DAB試劑盒配制DAB液，每張切片加100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3 min。自來水沖洗，蘇木精復染。自來水沖洗返藍。切片經過75%、80%、95%、95%、100%酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。實驗組與對照組分別于400倍光學顯微鏡下，隨機選取5個視野，記錄鏡下陽性細胞數，取其均數。

2 結果

免疫組化方法檢測致癇灶腦組織CX43的表達 實驗組及對照組腦組織中均檢測到CX43的陽性細胞，主要分布在細胞膜和細胞漿，經DAB染色，神經細胞胞漿及胞膜顯棕色，因不同腦區腦皮質細胞形態不同，故免疫反應陽性細胞的形態也不相同，癲癇患者腦皮質CX43抗體陽性細胞數均明顯增多，而正常腦皮質細胞胞漿及胞膜CX43抗體陽性細胞表達稀少(見表1，圖1～2)，差異有統計學意義。

表1 兩組患者腦組織中CX43陽性細胞的表達(±s)

表1 兩組患者腦組織中CX43陽性細胞的表達(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.001

組別 例數CX43對照組612.0 ±7.0實驗組 24 50.5 ±9.7*

圖1 對照組少量CX43陽性細胞表達(400倍)

圖2 實驗組CX43陽性細胞表達增多(400倍)

3 討論

縫隙連接是由鄰近兩個細胞細胞膜上相對應的半通道(hemichannel)對接而成，是目前所知細胞間惟一能直接交換物質和信息的通道［3］。而細胞間通過GJ為途徑直接進行的細胞間的信息交流成為縫隙連接細胞間通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)。GJ的基本結構單位是連接子(connexon)或稱半通道。連接子是由六個縫隙連接蛋白寡聚成的一種中空的親水性的環狀六聚體結構［4］。GJ中的半通道直徑約1.5nm，允許分子量小于1.0 kD和直徑小于1.5nm的小分子物質通過，如代謝分子、離子、第二信使(Ca2+，IP3，cAMP 和 ATP)及代謝產物如葡萄糖等通過［5］。CX是一類具有高度保守性的，由多基因編碼的膜蛋白［6］。CX的組織分布具有一定的特異性，而且不同CX組成的半通道可以相互配對排列組成不同種類的細胞間GJ。不同細胞細胞膜上GJ的種類及數目分布不同，其功能也不相同。數個至數千個GJ在細胞膜上成簇出現則形成縫隙連接斑(gap junction plaque)，GJ的數量決定著斑塊的大小以及GJIC的強度［7，8］。有11 種 CX 在中樞神經系統中表達，分別為 Cχ26，Cχ29，CX30，CX32，CX36，CX37，CX40，CX43，CX45，CX46 及CX47［9］。目前在中樞神經系統中研究較多的為 CX32及CX43，CX43在中樞神經系統表達最強，主要分布在星形膠質細胞上［10］，CX32在神經系統分布最多，主要在少突神經膠質細胞表達，同時在大腦皮質、海馬的錐體細胞、顆粒細胞、中腦和基底節神經元中也有較多的表達［11］。

有研究表明，在癲癇發作敏感動物的腦皮質中，神經元數目減少，而星形膠質細胞數目明顯增加，體積變大，突觸增多，并且相鄰星形膠質細胞之間GJ增多，與其相關的細胞因子也隨之發生變化。幾乎所有癲癇患者或動物模型腦組織中的星形膠質細胞，在形態、功能、數量上均有明顯改變。最近研究指出星形膠質細胞在中樞神經系統發揮重要的生理功能，如神經元的同步放電、離子平衡、神經遞質的調節、葡萄糖的代謝和調節血管張力等［12，13］。星形膠質細胞通過縫隙連接相互偶聯，能夠緩沖神經元興奮時釋放到細胞外的大量K+，維持了神經元細胞外環境的穩定［14］。現在越來越多的證據表明，功能失調星形膠質細胞在癲癇中發揮著關鍵作用［12］。CX43在星形膠質細胞上分布最多，其形成的縫隙連接，在膠質細胞間廣泛存在。在許多癲癇的研究中發現，CX43表達上調及GJ偶聯增加，Fonseca等觀察采用免疫熒光標記的膠原纖維酸性蛋白(GFAP)以及應用CX43抗體標記癲癇患者和健康人海馬組織，發現癲癇患者海馬組織中，不但星形膠質細胞間GJ偶聯進一步擴大，其CX43蛋白表達也明顯增加，提示上調星形膠質細胞CX43的表達能夠進一步加重全面性癲癇發作。且CX43的表達強度受癲癇持續時間的影響，癲癇時間愈長，CX43 的表達就愈多［15］。Nakase等［16］將敲除CX43基因的小鼠與CX43表達正常的小鼠在局灶性腦缺血后比較，發現CX43缺乏的小鼠凋亡細胞增多，表明GJ對凋亡有抑制作用。CX43可能與致癇后腦組織重塑有密切關系。由此我們可以推測星形膠質細胞上的GJ參與了癲癇活動，CX43對癲癇的發展中起到一定作用。

本實驗通過免疫組織化學及免疫電鏡方法對癲癇患者腦組織中CX43的表達進行觀察，結果顯示實驗組及對照組腦組織中均檢測到CX43的陽性細胞，實驗組腦組織CX43陽性細胞數為(50.5±9.7)，而對照組 CX43陽性細胞數為(12.0±7.0)，差異有統計學意義。CX43在難治性癲癇致癇灶腦組織中的表達增加，提示縫隙連接參與了癲癇的發生及發展，在腦皮質發育、神經網絡及環路的重組、神經細胞間離子通道的構成等方面發揮著重要作用。

［1］徐姜定.難治性癲癇治療進展.浙江臨床醫，2006，8(10):1009-1010.

［2］姚伯昕.縫隙連接與癲癇.海南醫學，2009，20(6):132-135.

［3］Nakagawa S，Maeda S，Tsukihara T.Structural and functional studies of gap junction channels.Curr Opin Struct Biol，2010，20(4):423-430.

［4］Goodenough DA，Paul DL.Gap junctions.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009，1(1):2576.

［5］Meldrum BS，Rogawski MA.Molecular targets for antiepileptic drug development.Neurotherapeutics，2007 4(1):18-61.

［6］Verma V，Larsen BD，Coombs W，et al.Novel Pharmacophores of Connexin43 Based on the“RXP”Series of Cx43-Binding Peptides.Circ Res，2009，105:176-184.

［7］Goodenough DA，Paul DL.Gap junctions.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009，1(1):2576.

［8］Orthmann-Murphy JL，Abrams CK，Scherer SS.Gap junctions couple astrocytes and oligodendrocytes.J Mol Neurosci，2008，35(1):101-116.

［9］Meldrum BS，Rogawski MA.Molecular targets for antiepileptic drug development.Neurotherapeutics，2007，4(1):18-61.

［10］Chew SS，Johnson CS，Green CR，et al.Role of connexin43 in central nervous system injury.Exp Neurol，2010，225(2):250-261.