難治性癲癇患者致癇灶中CX43的表達(dá)

張立志 馮俊強(qiáng) 陳晶 宋宏杉 陳業(yè)鵬

癲癇(epilepsy，EP)是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一，目前仍以藥物治療為主，約有80%的患者經(jīng)過系統(tǒng)的抗癲癇治療癥狀可緩解或治愈，但仍有20%左右對(duì)現(xiàn)有藥物治療無效，成為難治性癲癇［1］。癲癇的發(fā)病機(jī)制涉及諸多方面，其中神經(jīng)元之間的聯(lián)絡(luò)在癲癇發(fā)作中也起重要作用。神經(jīng)元之間最簡(jiǎn)單的信息傳遞形式是電突觸，而縫隙連接(gap junction，GJ)是神經(jīng)元電突觸的基本結(jié)構(gòu)［2］，所以縫隙連接、縫隙連接蛋白(connexin，CX)與癲癇的關(guān)系倍受研究者的關(guān)注。目前針對(duì)GJ與癲癇的研究很多，但難治性癲癇患者致癇灶腦組織CX43的表達(dá)情況鮮有報(bào)道。本研究利用免疫組織化學(xué)方法觀察24例難治性癲癇患者手術(shù)切除的致癇灶腦組織及因腦外傷手術(shù)切除的正常腦組織中CX43的表達(dá)情況，并進(jìn)行比較。進(jìn)一步闡明CX43形成的縫隙連接在癲癇活動(dòng)中的作用，為難治性癲癇的臨床研究及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 24例難治性癲癇手術(shù)患者中，男12例，女12 例，男女比例1∶1。年齡17 ～58 歲，平均(28.3±11.1)歲，近3個(gè)月發(fā)作頻率5～40次/月，平均(15.3±11.8)，患者病程2～29年，平均(8.3±7.8)。全部病例病史均在二年以上，經(jīng)過兩種或兩種以上抗癲癇藥物系統(tǒng)治療，癲癇發(fā)作每個(gè)月4次以上，經(jīng)影像學(xué)、頭皮長(zhǎng)程腦電圖或顱內(nèi)皮層腦電圖監(jiān)測(cè)明確致癇灶，具有手術(shù)指征者。所有患者均在皮層電極監(jiān)測(cè)下行致癇灶切除手術(shù)，切除病灶有額葉、顳葉、枕葉、海馬。術(shù)后病理證實(shí)為:腦組織皮質(zhì)分層紊亂，神經(jīng)元分布不均，膠質(zhì)細(xì)胞增生。對(duì)照組腦外傷急診手術(shù)6例患者，女2例，男4例，男女比例2∶1。年齡17～55歲，平均(36.5 ±16.8)歲，均無癲癇發(fā)作及癲癇病史。

1.2 標(biāo)本制作及腦組織中CX43表達(dá)的檢測(cè) 采集實(shí)驗(yàn)組24例及對(duì)照組6例手術(shù)切除腦組織，切塊并分別置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液和2%～3%戊二醛中固定。①免疫組織化學(xué)法檢測(cè)(SP法):標(biāo)本行石蠟包埋、切片、脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗3次，3 min/次。對(duì)組織抗原進(jìn)行熱修復(fù):pH6.0、0.01 mmol/L的檸檬酸抗原修復(fù)液中煮沸15 min。應(yīng)用SP超敏試劑盒按照說明進(jìn)行操作。應(yīng)用DAB試劑盒配制DAB液，每張切片加100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3 min。自來水沖洗，蘇木精復(fù)染。自來水沖洗返藍(lán)。切片經(jīng)過75%、80%、95%、95%、100%酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別于400倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，記錄鏡下陽性細(xì)胞數(shù)，取其均數(shù)。

2 結(jié)果

免疫組化方法檢測(cè)致癇灶腦組織CX43的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組腦組織中均檢測(cè)到CX43的陽性細(xì)胞，主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，經(jīng)DAB染色，神經(jīng)細(xì)胞胞漿及胞膜顯棕色，因不同腦區(qū)腦皮質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不同，故免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞的形態(tài)也不相同，癲癇患者腦皮質(zhì)CX43抗體陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，而正常腦皮質(zhì)細(xì)胞胞漿及胞膜CX43抗體陽性細(xì)胞表達(dá)稀少(見表1，圖1～2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組患者腦組織中CX43陽性細(xì)胞的表達(dá)(±s)

表1 兩組患者腦組織中CX43陽性細(xì)胞的表達(dá)(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.001

組別 例數(shù)CX43對(duì)照組612.0 ±7.0實(shí)驗(yàn)組 24 50.5 ±9.7*

圖1 對(duì)照組少量CX43陽性細(xì)胞表達(dá)(400倍)

圖2 實(shí)驗(yàn)組CX43陽性細(xì)胞表達(dá)增多(400倍)

3 討論

縫隙連接是由鄰近兩個(gè)細(xì)胞細(xì)胞膜上相對(duì)應(yīng)的半通道(hemichannel)對(duì)接而成，是目前所知細(xì)胞間惟一能直接交換物質(zhì)和信息的通道［3］。而細(xì)胞間通過GJ為途徑直接進(jìn)行的細(xì)胞間的信息交流成為縫隙連接細(xì)胞間通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)。GJ的基本結(jié)構(gòu)單位是連接子(connexon)或稱半通道。連接子是由六個(gè)縫隙連接蛋白寡聚成的一種中空的親水性的環(huán)狀六聚體結(jié)構(gòu)［4］。GJ中的半通道直徑約1.5nm，允許分子量小于1.0 kD和直徑小于1.5nm的小分子物質(zhì)通過，如代謝分子、離子、第二信使(Ca2+，IP3，cAMP 和 ATP)及代謝產(chǎn)物如葡萄糖等通過［5］。CX是一類具有高度保守性的，由多基因編碼的膜蛋白［6］。CX的組織分布具有一定的特異性，而且不同CX組成的半通道可以相互配對(duì)排列組成不同種類的細(xì)胞間GJ。不同細(xì)胞細(xì)胞膜上GJ的種類及數(shù)目分布不同，其功能也不相同。數(shù)個(gè)至數(shù)千個(gè)GJ在細(xì)胞膜上成簇出現(xiàn)則形成縫隙連接斑(gap junction plaque)，GJ的數(shù)量決定著斑塊的大小以及GJIC的強(qiáng)度［7，8］。有11 種 CX 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，分別為 Cχ26，Cχ29，CX30，CX32，CX36，CX37，CX40，CX43，CX45，CX46 及CX47［9］。目前在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中研究較多的為 CX32及CX43，CX43在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最強(qiáng)，主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞上［10］，CX32在神經(jīng)系統(tǒng)分布最多，主要在少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，同時(shí)在大腦皮質(zhì)、海馬的錐體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、中腦和基底節(jié)神經(jīng)元中也有較多的表達(dá)［11］。

有研究表明，在癲癇發(fā)作敏感動(dòng)物的腦皮質(zhì)中，神經(jīng)元數(shù)目減少，而星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯增加，體積變大，突觸增多，并且相鄰星形膠質(zhì)細(xì)胞之間GJ增多，與其相關(guān)的細(xì)胞因子也隨之發(fā)生變化。幾乎所有癲癇患者或動(dòng)物模型腦組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞，在形態(tài)、功能、數(shù)量上均有明顯改變。最近研究指出星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要的生理功能，如神經(jīng)元的同步放電、離子平衡、神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)、葡萄糖的代謝和調(diào)節(jié)血管張力等［12，13］。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過縫隙連接相互偶聯(lián)，能夠緩沖神經(jīng)元興奮時(shí)釋放到細(xì)胞外的大量K+，維持了神經(jīng)元細(xì)胞外環(huán)境的穩(wěn)定［14］。現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，功能失調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［12］。CX43在星形膠質(zhì)細(xì)胞上分布最多，其形成的縫隙連接，在膠質(zhì)細(xì)胞間廣泛存在。在許多癲癇的研究中發(fā)現(xiàn)，CX43表達(dá)上調(diào)及GJ偶聯(lián)增加，F(xiàn)onseca等觀察采用免疫熒光標(biāo)記的膠原纖維酸性蛋白(GFAP)以及應(yīng)用CX43抗體標(biāo)記癲癇患者和健康人海馬組織，發(fā)現(xiàn)癲癇患者海馬組織中，不但星形膠質(zhì)細(xì)胞間GJ偶聯(lián)進(jìn)一步擴(kuò)大，其CX43蛋白表達(dá)也明顯增加，提示上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞CX43的表達(dá)能夠進(jìn)一步加重全面性癲癇發(fā)作。且CX43的表達(dá)強(qiáng)度受癲癇持續(xù)時(shí)間的影響，癲癇時(shí)間愈長(zhǎng)，CX43 的表達(dá)就愈多［15］。Nakase等［16］將敲除CX43基因的小鼠與CX43表達(dá)正常的小鼠在局灶性腦缺血后比較，發(fā)現(xiàn)CX43缺乏的小鼠凋亡細(xì)胞增多，表明GJ對(duì)凋亡有抑制作用。CX43可能與致癇后腦組織重塑有密切關(guān)系。由此我們可以推測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞上的GJ參與了癲癇活動(dòng)，CX43對(duì)癲癇的發(fā)展中起到一定作用。

本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)及免疫電鏡方法對(duì)癲癇患者腦組織中CX43的表達(dá)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組腦組織中均檢測(cè)到CX43的陽性細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組腦組織CX43陽性細(xì)胞數(shù)為(50.5±9.7)，而對(duì)照組 CX43陽性細(xì)胞數(shù)為(12.0±7.0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CX43在難治性癲癇致癇灶腦組織中的表達(dá)增加，提示縫隙連接參與了癲癇的發(fā)生及發(fā)展，在腦皮質(zhì)發(fā)育、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及環(huán)路的重組、神經(jīng)細(xì)胞間離子通道的構(gòu)成等方面發(fā)揮著重要作用。

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