乳腺癌細(xì)胞膜蛋白的SELDI－TOF－MS分析

韻雪雪，楊永長，姜 偉，肖代雯，閆 慧，黃文芳＊

（1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院，四川 成都610072；2.重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗系 臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室，重慶400016）

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害育齡婦女健康的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的7－10%，據(jù)統(tǒng)計，全球每年發(fā)病約250萬人，50萬人死亡。2004年Jemal等統(tǒng)計，早期診斷乳腺癌五年生存率可達(dá)97%，而擴散后的五年生存率僅為23%［1］。影像學(xué)檢查和CA－153標(biāo)志物是目前乳腺癌檢查常用的技術(shù)指標(biāo)，但由于乳腺炎癥，射線過敏和敏感性方面的問題［2，3］，不足以滿足臨床和大規(guī)模篩查的需要，細(xì)胞膜在細(xì)胞生命活動中發(fā)揮重要作用，已有研究發(fā)現(xiàn)膜蛋白腫瘤過程中發(fā)生特異性變化［4］，SELDI－TOF－MS是目前蛋白研究的先進(jìn)技術(shù)，具有高通量，檢測快速，敏感度和特異性高，分析全面精確的特點，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，本實驗擬通過SELDI－TOF－MS分析乳腺癌及正常乳腺細(xì)胞株膜，尋找差異蛋白，為乳腺癌亞細(xì)胞蛋白水平標(biāo)志物的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人類乳腺正常細(xì)胞株HBL－100購自上海中科院細(xì)胞庫，人類乳腺癌細(xì)胞株MDA－MB－231及MCF－7均由重慶醫(yī)科大學(xué)惠贈。

1.1.2 主要試劑及來源 細(xì)胞膜蛋白提取試劑盒購自Sigma公司，小牛血清，1640培養(yǎng)基，0.25%胰酶均購自GIBCO公司，TritonX－114購自Amresco公司，芥子酸（SPA）、乙腈（ACN）、三氟乙酸（TFA）、細(xì)胞色素C和肌紅蛋白均購自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱由德國Heraeus生產(chǎn)；表面增強激光解吸蛋白飛行時間質(zhì)譜（SELDITOF－MS）儀、Au蛋白質(zhì)芯片為Ciphergen公司產(chǎn)品；Vortex－Genie 2渦旋振蕩器為美國Scientific Industries公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與收集細(xì)胞MDA－MB－231，MCF－7，HBL－100培養(yǎng)于含有10%的小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞貼壁70－90%時傳代，加入PBS洗2次，2×107每管凍于－80℃冰箱保存。

1.2.2 膜蛋白蛋白的分離純化 膜蛋白的分離純化按照試劑盒說明進(jìn)行，步驟為：①每管細(xì)胞中加入600μl的裂解液，冰浴10min，②4℃×10 000g離心細(xì)胞5min，轉(zhuǎn)移上清至以新的管中，③37℃孵育5min，可以觀察到液體變?yōu)樵旗F狀渾濁。④37℃×3 000g離心3min，棄上清下部沉淀為細(xì)胞膜脂筏蛋白和疏水性蛋白。

1.2.3 丙酮沉淀 加預(yù)冷丙酮至膜蛋白提取物，－20℃冰箱沉淀過夜，4℃×12 000g離心10min，棄上清重復(fù)丙酮沉淀即為膜蛋白，加4‰Tritonx－114充分溶解。

1.2.4 蛋白定量 Olympus AU 2700生化分析儀檢測各管中蛋白量，用4‰TritonX－114調(diào)節(jié)樣品濃度為100μg／μl。

1.2.5 質(zhì)量校準(zhǔn) SELDI－TOF－MS儀每次使用前，采用蛋白標(biāo)準(zhǔn)品胰島素、細(xì)胞色素C和肌紅蛋白對SELDI－TOF－MS進(jìn)行相對分子質(zhì)量校準(zhǔn)，確保系統(tǒng)的質(zhì)量偏差范圍控制在0.1%以內(nèi)。

1.2.6 SELDI－TOF－MS分析蛋白指紋圖譜 10 μl 50%飽和SPA（能量分子，含50%ACN和0.5%TFA）與經(jīng)過處理的等體積膜蛋白樣品混合，上樣Au蛋白芯片，每孔4μl，每個標(biāo)本重復(fù)2條芯片，每條2個點，待干后每孔重復(fù)加入1μl SPA2次，完全干燥后，選擇激光強度為190，靈敏度為8，SELDITOF－MS分析蛋白指紋圖譜，Protein－chip Software Bio－maker自動采集數(shù)據(jù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)收集處理 采用Biomarker Wizard 3.1軟件對乳腺癌和正常乳腺細(xì)胞線粒體蛋白質(zhì)分別進(jìn)行指紋圖譜分析，設(shè)定有意義的蛋白質(zhì)峰出現(xiàn)頻率閾值為10%，分別設(shè)定5，2兩次信噪比（S／N）過濾。確定兩組間蛋白質(zhì)峰值比較時，對初步篩選的蛋白質(zhì)峰進(jìn)行t檢驗，以P＜0.05篩選差異蛋白。

1.2.8 溶劑影響 4‰TritonX－114與SPA等量混合，按照1.2.6條件點樣分析蛋白指紋圖。

1.2.9 長期凍存對結(jié)果影響 選擇－80℃凍存達(dá)3－6個月的細(xì)胞，提取膜蛋白分析指紋圖譜，與新收集細(xì)胞膜蛋白指紋圖譜比較，觀察兩者蛋白峰數(shù)目及豐度有無統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞膜蛋白指紋圖譜分析結(jié)果

經(jīng)蛋白指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)化后，MDA－MB－231和MCF－7與HBL－100相比，膜蛋白差異點分別為32個和34個（P＜0.05），其中7.8kD，8.3kD和8.8 kD的蛋白在兩株癌細(xì)胞中表達(dá)均降低，9.6kD的蛋白在兩株癌細(xì)胞中表達(dá)均增高，見表1和圖1、2。

表1 乳腺正常細(xì)胞膜與乳腺癌細(xì)胞膜差異蛋白（kD）

圖1 分子量7.8kD和8.3kD的差異蛋白指紋圖

圖2 分子量8.8kD和9.6kD的差異蛋白指紋圖

2.2 溶液對結(jié)果影響分析

蛋白指紋圖譜分析4‰TritonX－114點樣Au蛋白芯片后除基質(zhì)峰外無任何蛋白峰，證明該濃度TritonX－114對結(jié)果分析無影響，見圖3。

圖3 芯片洗滌后點樣4‰TritonX－114分析圖譜

2.3 長期凍存對結(jié)果影響分析

新鮮提取細(xì)胞與凍存3－6個月的細(xì)胞線粒體蛋白指紋圖譜比較，兩者在蛋白峰的數(shù)量和豐度上均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），表明在此時間范圍內(nèi)保存不影響結(jié)果分析，見圖4。

圖4 新鮮細(xì)胞與凍存細(xì)胞膜蛋白指紋圖譜

3 討論

細(xì)胞膜蛋白約占蛋白總量的1／3，在信號傳遞，物質(zhì)轉(zhuǎn)運方面發(fā)揮重要的作用，腫瘤細(xì)胞膜蛋白連接數(shù)量少而且發(fā)育差，微絨毛數(shù)量增多，一些質(zhì)膜蛋白如受體蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白、黏附蛋白、抗原蛋白等過量表達(dá)、缺失或發(fā)生修飾，使細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運輸、黏附作用、免疫原性等發(fā)生改變，與腫瘤細(xì)胞的惡性行為如侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。同時膜蛋白是藥物作用靶點之一，目前80%臨床使用藥物的靶點都集中在膜蛋白上，細(xì)胞膜蛋白改變時，會引起細(xì)胞對藥物的反應(yīng)改變，導(dǎo)致化療失敗。在乳腺癌中，Jensen等［5］研究發(fā)現(xiàn)一種以γ－氨基丁酸A型受體為配體的氯離子通道蛋白異常表達(dá)。Garcia Pedrero JM［6］等發(fā)現(xiàn)AnnexinA1在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，其下調(diào)程度與其上皮分化狀態(tài)、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、組織病理學(xué)分級密切相關(guān)，惡性程度越高，表達(dá)下調(diào)程度越明顯。Adam P J等［7］通過對乳腺癌細(xì)胞質(zhì)膜大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析，建立了500多個的蛋白的乳腺癌細(xì)胞質(zhì)膜蛋白數(shù)據(jù)集，其中27%功能未知，進(jìn)一步的定位實驗、相互作用分析和免疫組化發(fā)現(xiàn)了3個以前未鑒定的蛋白質(zhì)BCMP11、BCMP84和BCMP101可能在癌變過程中起作用。

SELDI－TOF－MS問世以來，因其分析速度快，相對分子質(zhì)量范圍大，可以有效捕獲低分子量、低豐度的蛋白的特點，在亞細(xì)胞蛋白研究中得到極大的應(yīng)用，已通過SELDI－TOF－MS在乳腺癌全細(xì)胞蛋白研究中捕獲標(biāo)志物［8］。本實驗利用SELDI－TOFMS檢測兩株乳腺癌及一株乳腺正常上皮細(xì)胞株膜蛋白，發(fā)現(xiàn)分子量7.8kD，8.3kD和8.8kD的蛋白在兩株癌細(xì)胞中表達(dá)均降低，分子量9.6kD的蛋白在兩株癌細(xì)胞中表達(dá)均增高。同時本實驗選擇的Au芯片，與以往CM10，WCX等相比，可以重復(fù)利用，成本極低，適合大面積篩查。在標(biāo)本保存時間上，比較－80℃凍存3－6月的細(xì)胞膜蛋白與新鮮細(xì)胞膜蛋白指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)兩者在蛋白峰數(shù)目及豐度均無統(tǒng)計學(xué)差異，表明在此范圍內(nèi)保存不影響指紋圖譜分析，與既往研究一致［9］。提示本實驗可用于長期保存標(biāo)本的研究。

本實驗在亞細(xì)胞水平初步篩選出了乳腺癌特異性蛋白，但能否將篩選的蛋白用于乳腺癌的診斷，還有很長的路要走。在下一步實驗中，我們對差異蛋白分離、純化和鑒定，同時收集各種類型的臨床標(biāo)本進(jìn)行驗證，以期為乳腺癌標(biāo)志物研究鑒定更多依據(jù)。

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