GDF-5誘導hADSCs分化為軟骨樣細胞

金長禮 李德華 李洪秀 樸仁京

軟骨組織損傷及退變是常見疾病，由于其缺少血管和神經的支配，一旦損傷很難自身修復［1］。目前傳統的手術切除或填充外源性假體，均無明顯效果，而極易導致繼發性骨軟骨炎。隨著組織工程學在修復和治療領域的發展，為修復軟骨組織損傷帶來了新契機。種子細胞是組織工程學的首要因素，自體軟骨細胞是目前惟一批準用于臨床的種子細胞，但其存在來源受限、形成二次損傷、體外擴增困難、容易老化等缺點［2］。找到一種自體來源的軟骨種子細胞意義重大。

2001年Zuk等［3］從人吸脂術的脂肪組織中分離出具有多向分化潛能的細胞群，命名為脂肪來源的間充質干細胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)，hADSCs可以自體取材，對機體損傷小、取材方便，單位體積組織內干細胞含量大，因此成為組織工程領域最具優勢的種子細胞。但如何成功誘導hADSCs分化為軟骨樣細胞尚無定論，本研究旨在探索一種簡單有效的誘導方案，使hADSCs成為軟骨細胞的新來源。

1 材料與方法

1.1 組織來源 脂肪組織來自5例行腹部脂肪抽吸術的健康成年女性患者，年齡22～45歲，無傳染病和內分泌疾病，并簽署知情同意書，實驗經醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 低糖DMEM、高糖DMEM、胎牛血清、MTT、DMSO(Gibco);Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、抗壞血酸、丙酮酸鈉、地塞米松、胰島素、甲苯胺藍(Sigma);GDF-5(PeproTeeh Inc);兔多抗Ⅱ型膠原抗體、SABC試劑盒(博士德生物試劑公司)。

1.3 hADSCs的分離培養 取人抽脂術后的無菌脂肪組織，PBS浸泡沖洗以去除紅細胞;加入2倍體積0.1%的Ⅰ型膠原酶，37℃水浴消化60 min，含10%胎牛血清的低糖-DMEM終止消化。4℃、2000 r/min離心10 min，低糖DMEM重懸沉淀，200目濾網過濾。4℃、2000r/min離心10 min，低糖DMEM重懸沉淀，移入培養瓶，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。24 h后首次換液，去除未貼壁細胞，之后每3 d換液1次，細胞達80%融合時傳代培養。倒置相差顯微鏡下觀察。

1.4 hADSCs的增殖活性檢測 用MTT法檢測細胞增殖活性。取P3、P5、P10的hADSCs，以1×104/ml的密度接種于96孔板，于37℃、5%CO2條件下培養。24 h后的連續5 d，每天同一時間，隨機抽取一板，加入5 mg/ml的MTT(20 μl/孔)，37℃孵育4 h，吸棄培養液，每孔加入150 μl的DMSO震蕩10 min，酶標儀測定波長在570nm處的吸光值。以時間(d)為橫軸，吸光值(OD)為縱軸，繪制生長曲線。

1.5 誘導hADSCs分化為軟骨細胞 取P3的hADSCs，制成密度為106/ml的細胞懸液，接種于蓋有玻片的6孔板，細胞達90%融合時更換軟骨誘導培養液。按GDF濃度不同分3組:A，0 ng/mlGDF;B，50 ng/mlGDF;C，100 ng/mlGDF-5。另均含10-7mol/L地塞米松、37.5 mg/L抗壞血酸、1 μmol/L胰島素，10%FBS 的 H-DMEM，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，每3 d換液，相差顯微鏡觀察。

1.6 檢測Ⅱ型膠原的表達 取誘導28 d的細胞爬片，4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-100孵育，3%H2O2室溫孵育，以消除內源性過氧化物酶活性。5%BSA封閉后加入兔多抗Ⅱ型膠原(1∶200)，4℃過夜。滴加山羊抗兔的二抗37℃孵育30 min。滴加SABC試劑，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水，透明，封片，光鏡下觀察，以上步驟均用PBS沖洗。結果判定:細胞胞漿內可見不同程度的棕黃色顆粒為陽性表達。

1.7 甲苯胺藍染色檢測GAG 取誘導28 d細胞爬片，PBS漂洗2 min，4%多聚甲醛固定30 min。自來水沖洗15 min，蒸餾水洗5 min，加1%甲苯胺藍2 h，95%乙醇去除多余染液。干燥后，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 hADSCs的形態學觀察 原代培養的hADSCs接種24 h，可見少量細胞貼壁，細胞呈短梭形或多角形。3 d后細胞體積逐漸增大，呈長梭形，似成纖維細胞，呈渦輪狀緊密排列。10 d左右細胞達到90%融合(圖1)。傳代細胞生長速度明顯加快，3～5 d即達80%融合。10 d以后，增殖速度無明顯減慢。

圖1 原代培養10 d的hADSCs(100)

2.2 hADSCs的生長曲線 MTT結果顯示hADSCs傳代培養的第1～2天為潛伏期，2～4 d為指數增殖期細胞逐漸融合，第4天后進入平臺期并達到峰值。P3，P5，P10細胞的生長曲線均呈“S”形(圖2)，統計分析數據表明3種不同代的hADSCs每天的OD值差異無統計學意義(P＞0.05)，表明多次傳代的hADSCs增殖能力沒有降低。

圖2 細胞生長曲線

2.3 成軟骨誘導后細胞的形態學觀察 C組(100 ng/ml GDF-5)誘導7 d可見細胞由長梭形逐漸變為多角形，14 d大部分細胞變成圓形或者類圓形，21 d圓形細胞數量增加，在某些區域細胞聚集生長，形成軟骨樣結節(圖3a)。而B組(50 ng/mlGDF-5)誘導10 d細胞逐漸變為多角形，21 d細胞形態逐步變為圓形或類圓形(圖3b)，形態改變相對滯后。

圖3 a 誘導21 d細胞(C:100 ng/ml GDF-5組，100)

圖3 b 誘導21 d細胞(C:100 ng/ml GDF-5組，100)

2.4 Ⅱ型膠原免疫細胞化學檢測結果 誘導28 d的細胞行免疫細胞化學染色，可見細胞核藍染，胞漿呈棕黃色，Ⅱ型膠原表達陽性。C組(100 ng/ml GDF-5)細胞著色深，表達陽性細胞數量多(圖4a)。B組(50 ng/ml GDF-5)細胞著色淺，表達陽性細胞數量少(圖4b)。

圖4 a 免疫細胞化學染色(C:100 ng/ml GDF-5組，100)

圖4 b 免疫細胞化學染色(B:50 ng/ml GDF-5組，100)

2.5 甲苯胺藍染色檢測GAG 誘導28 d細胞甲苯胺藍染色，GAG表達陽性。C組(100 ng/ml GDF-5)藍染細胞數量多，顏色深(圖5a)。B組(50 ng/ml GDF-5)藍染細胞數量少，顏色淺(圖5b)。

圖5 a 甲苯胺藍染色(C:100 ng/ml GDF-5組，100)

圖5 b 甲苯胺藍染色(B:50 ng/ml GDF-5組，100)

3 討論

近年組織工程學為修復軟骨組織損傷帶來了新契機，種子細胞是組織工程學的首要因素，自體軟骨細胞存在來源有限、二次損傷、體外擴增困難等缺點，無法廣泛應用于臨床，尋找新的軟骨細胞來源尤為重要［4］。2001年Zuk等從人吸脂術的無菌脂肪組織中分離培養出hADSCs，其具有與BMSCs相似的多向分化潛能，可向骨、肌肉、脂肪、軟骨和內皮等方向分化［3］。因其可以自身取材、分離培養簡單方便、單位體積組織內干細胞含量大、分化表型可長期維持、衰老較為緩慢等優點，迅速成為組織工程學和再生醫學等領域的研究熱點，并取得了可喜的進展。本實驗采用Ⅰ型膠原酶消化法分離培養hADSCs，接種24 h可見細胞貼壁，細胞呈短梭形或多角形。3 d后細胞體積增大，呈長梭形，可見核分裂相。7 d后細胞融合達到90%，細胞呈長梭形，形態、大小一致，呈渦輪狀緊密排列。傳代細胞生長形態均一，增殖能力強，P10代以后的增殖能力僅稍弱于P3代細胞。

在誘導hADSCs分化為軟骨樣細胞的諸多因素中，生長因子起到了決定性作用。常用于軟骨誘導的生長因子有TGF-β、IGF-1、bFGF、BMP［5］等。其中 TGF-β 被公認為成軟骨分化的特異性生長因子［6］。但hADSCs表面缺乏可以介導TGF-β信號傳遞的受體，無法被TGF-β誘導分化為軟骨樣細胞。生長分化因子5(growth differentiation factor 5，GDF-5)又稱軟骨形態發生蛋白-1(cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP-1)或骨形態發生蛋白-14(bone morphogenetic protein，BMP-14)，是TGF-β超家族中的一員，它可促進早期軟骨和關節形成［7］。向大鼠損傷軟骨組織內注射GDF-5的實驗證明GDF-5可以促進軟骨細胞分泌Ⅱ型膠原和細胞外基質中GAG的積累［8］，本實驗采用不同濃度的GDF-5來誘導hADSCs分化。其中誘導培養液中的地塞米松抑制hADSCs向脂肪樣細胞分化，胰島素是體外培養的細胞成活、有絲分裂、糖原合成必不可少的，色氨酸存在抑制有絲分裂的因子，BSA和脯氨酸作為細胞的營養成分，促進細胞合成膠原。丙酮酸鈉是細胞培養中的替代碳源。谷胺酰胺可補充必需氨基酸，維生素C是抗氧化劑，可抑制或減少凋亡［9］。

通過3個誘導組的培養，觀察發現C組的細胞由長梭形逐漸變為多角形甚至圓形或者類圓形的時間早于B組，而且圓形細胞數量也多，在某些區域細胞聚集生長，形成軟骨樣結節。而B組細胞的形態改變相對滯后。A組細胞形態無明顯變化。GAG是軟骨組織中含量最大的蛋白聚糖［10］。本實驗對誘導28 d的細胞進行甲苯胺藍染色，C組藍染細胞數量多，顏色深。B組藍染細胞數量少，顏色淺。Ⅱ型膠原是軟骨細胞的特異性蛋白［11］，經免疫細胞化學染色觀察C組細胞胞漿呈棕黃色陽性表達，核藍染，而且陽性表達的細胞數量多。B組細胞著色淺，陽性表達的細胞數量少。

綜上所述，本實驗從人抽脂術的無菌脂肪組織中成功分離培養hADSCs，獲得細胞數量大、形態均一、體外增殖迅速，具有干細胞特性。50、100 ng/ml的 GDF-5可在體外誘導hADSCs分化為軟骨樣細胞，具有軟骨細胞的形態，表達了軟骨細胞特異性的蛋白和糖胺聚糖。而100 ng/ml GDF-5的誘導效果更顯著。hADSCs可以作為軟骨修復的種子細胞來源。此項研究為今后應用于軟骨組織工程提供了種子細胞相關的參考依據。

［1］Maurizio Pacifici.Cellular and molecular mechanisms of synovial joint and articular cartilage formation.Ann N Y Acad Sci，2006，1068(4):74-86.

［2］Cindy Chung，Jason A，Burdick.Engineering cartilage tissue.Adv Drug Deliv Rev，2008，60(2):243-262.

［3］Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell-based therapies.Tissue Eng，2001，7(2):211-228.

［4］Steven B.Abramson，Mukundan Attur.Developments in the scientific understanding of osteoarthritis.Arthritis Research ＆ Therapy，2009，11(9):227-35.

［5］Andre F，Steinert.Concepts in gene therapy for cartilage repair.Injury，2008，39(11):97-113.

［6］Benjamin D，Elder MS，Kyriacos A，et al.Assessment of growth factor treatment on.Biochemical and biomechanical properties of engineered articular cartilage constructs.Osteoarthritis Cartilage，2009，17(1):114-123.

［7］Gang Feng，Yuqing Wan.Adenovirus-mediated expression of growth and differentiationfactor-5 promotes chondrogenesis of adipose stem cells.Growth Factors，2008，26(3):132-142.

［8］Koichi Masuda.Biological repair of the degenerated intervertebral disc by the injection of growth factors.Eur Spine J，2008，17(4):441-451.

［9］Andrew J，Rosenbaum et al.The use of mesenchymal stem cells in tissue engineering.Organogenesis，2008，4(1):23-27.

［10］Tania Rozario，Douglas W，De Simone.The extracellular Matrix in development and morphogenesis:a dynamic view.Dev Biol，2010，341(1):126-140.

［11］Olsen AK，Sondergaard BC，Byrjalsen I，et al.Anabolic and catabolic function of chondrocyte exvivo is reflected by the metabolic processing of type II collagen.Osteoarthritis Cartilage，2007，15(9):335-342.