力竭游泳訓練后大鼠伏核5-羥色胺陽性細胞的表達

李克 王進 劉永林

5-羥色胺(5-Hydroxyptamine，5-HT)是一種吲哚衍生物，廣泛存在于哺乳動物組織內。5-羥色胺遞質系統也比較集中，其神經元主要位于低位腦干近中線區的中縫核內。按其纖維投射途徑的不同，也可分為三部分:上行部分、下行部分和支配低位腦干部分。上行部分的神經元位于中縫核上部，其神經纖維投射到紋狀體、丘腦、下丘腦、邊緣前腦和大腦皮層。腦內5-羥色胺主要來自中縫核上部，破壞中縫核上部可使腦內5-羥色胺含量明顯降低。

伏核(nucleus accumbens，NAc)是錐體外系的重要組成部是把情緒動機轉化為運動的神經界面，是邊緣運動的接口［1］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 雄性Wistar大鼠 沈陽醫學院動物室提供，5-HT試劑盒(購于Sigma公司);LUZEX-F顯微圖像分析儀(日本，松下公司)

1.2 實驗動物分組 本實驗選用雄性健康Wistar大鼠40只，體重260～300 g，隨機分成兩組。正常對照組:20只。實驗組:20只。

1.3 實驗方法

1.3.1 力竭游泳訓練大鼠模型制備 大鼠在長1.5 m，寬0.8 m，高0.6 m，水深0.5 m，水溫(35±2)℃的游泳池內進行訓練，時間為1周。力竭游泳訓練的標準為:大鼠游泳動作明顯失調，且沉入水中10 s不再浮起［2］。

1.3.2 組化標本制備 對實驗動物用1%戊巴比妥鈉(40 ml/Kg)腹腔麻醉后開胸，經左心室70滴/min滴入1%肝素鈉的生理鹽水500 ml，同時剪開右心耳。繼用0.1 m磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出實驗動物的腦組織，放入含4%多聚甲醛PBS的固定液中進行后固定大約2 h，之后將實驗動物的腦組織切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至組織薄片沉底，經水包埋，恒冷箱連續橫切片，片厚20 μm。經OCT包埋，恒冷箱連續切片，片厚16 μm，-70℃保存備用。

1.3.3 尼氏染色 冰凍切片吹干，經PBS漂洗5 min 3次，將切片置入1%甲苯胺藍溶液中37℃孵育90 min，取出后用蒸餾水沖洗，PBS漂洗5 min 3次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3.4 5-HT染色方法 ①冰凍切片吹干，PBS沖洗5 min 3次。②1:50正常羊血清中孵育30 min。③傾去血清，加入兔抗5-HT抗體(1:4000)，4℃過夜。④PBS沖洗5 min 3次。⑤滴加生物素化抗兔抗體(二抗)1:40稀釋，室溫孵育60 min。⑥PBS沖洗5 min 3次。⑦滴加HRP標記的卵白素1:40稀釋，室溫孵育60 min。⑧PBS沖洗5 min 3次。⑨DAB成色5 min。⑩PBS沖洗5 min 3次。[11]梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。[12]對照實驗在鄰近切片上進行，用抗原吸收后的一抗代替一抗，結果為陰性。

1.4 顯微圖像定量分析 用Luzex-F顯微圖像分析儀測定伏核內單位面積5-HT陽性反應物平均灰度值，所得數據經計算機SAS軟件系統進行統計學處理，用±s表示。

2 結果

2.1 尼氏染色結果 正常對照組大鼠伏核內神經原細胞的尼氏染色切片上，神經元數量較多，排列緊密，形態完整，泡漿有內尼氏體。

實驗組伏核內細胞，正常神經元數量明顯增多，細胞豐滿，泡漿內尼氏體豐富。根據尼氏染色說明力竭訓練大鼠模型制備成功。

2.2 5-HT染色結果 正常對照組可見5-HT陽性反應物分布于大鼠伏核內，分布于胞質及突起，胞核不著色，細胞形態完整但細胞數量少，纖維豐富。與正常對照組比較，實驗對照組5-HT陽性反應物大量增多(P＜0.01)可見大量陽性細胞及陽性纖維。見表1和圖1。

表1 力竭游泳訓練后大鼠與正常大鼠伏核單位面積5-HT陽性物反應物平均灰度值(±s)

表1 力竭游泳訓練后大鼠與正常大鼠伏核單位面積5-HT陽性物反應物平均灰度值(±s)

注:*與正常組比較P＜0.01

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圖1 力竭游泳訓練后大鼠與正常大鼠伏核單位面積5-HT陽性物反應物平均灰度值

3 討論

NAc是錐體外系的重要結構，伏核參與腹側環路啟動的運動，主要影響并參與運動相關的情感和動機反應。

5-HT是分布與腦干中縫核簇內的重要神經遞質，它通過廣泛的纖維投射和多種受體的介導，參與多種機體的生理活動［3］。過量的5-HT可能在中樞系統引起人體疲勞，在運動情況下，無論是間歇性運動或持續性運動，都會使游離色氨酸更容易進入腦內，使腦內5-HT濃度升高，使肌體出現疲勞。本實驗的結果表明經過力竭游泳訓練的雄性大鼠的紋狀神經元內5-HT陽性反應物大量增多。提示，運動鍛煉對大鼠的伏核神經元內5-HT陽性反有一定的影響、根據這一結果，我們推測，經力竭游泳訓練后軀體運動的協調性顯著增強，除了與肌肉的張力有關外，與神經遞質功能增強有一定關系［4］。5-HT可以作為力竭訓練強度的檢測指標。

［1］Femandez-Espejo E.How does the nucleus accumbens function.Rev Neurol，2000，30:845-849.

［2］朱全，浦鈞宗.大鼠游泳訓練在運動實驗中的應用.中國運動醫學雜志，1996，15(10):125.

［3］鄒慧莉，趙廣宇宿長軍，等.快速眼動睡眠剝奪對中樞5-羥色胺缺失小鼠orexin陽性神經元活性的影響.神經解剖學雜志，2009，25(3):312-316.

［4］Andersen P.Pathwag of postsgnaptic inhibition in the hipp ocanpus.Neurophgsiol，1964，27:608.