流產模型孕鼠脾臟調節性T細胞分離純化方法的初步建立

殷治華 趙富璽 穆雅琴 劉潤花 王健 馮婷婷 齊彥

妊娠是極其復雜的生理過程，近代生殖免疫學研究認為，正常妊娠的維持有賴于母胎免疫耐受的形成［1］，一旦母胎免疫失衡，可能發生原因不明復發性流產(URSA)的病理妊娠。而調節性T細胞(Treg細胞)對于母體免疫耐受胎兒必不可少，是調控母胎免疫耐受形成的重要因素［2］。

在不明原因復發性流產的研究中，探討Treg細胞中轉錄因子FoxP3對細胞因子受體表達調控的分子機制，我們是以孕鼠(流產模型和正常對照)脾臟淋巴細胞為研究對象的，我們可以通過CD熒光抗體標記后，再以免疫磁珠細胞分選法(MACS)或流式細胞分選法(FACS)獲得Treg細胞。因此，建立有效的流產模型孕鼠脾臟淋巴細胞分離技術是進行這些研究的先決條件。本文采用免疫磁珠細胞分選法對流產模型孕鼠脾臟Treg細胞進行分離，并對流產模型孕鼠脾臟Treg細胞的純度和活性及獲得率進行分析。

1 材料和方法

1.1 研究對象 經與雄性DBA/2J孕鼠(購自北京華阜康公司)交配受孕的雌性CBA/J孕鼠(購自上海斯萊克公司)，飼養于山西大同大學免疫研究所動物室。

1.2 主要試劑 小鼠淋巴細胞分離液;紅細胞裂解液;小鼠CD4+CD25+調節性T細胞磁珠分選試劑盒;大鼠抗小鼠CD4-FITC標記、大鼠抗小鼠CD25-PE標記的單克隆抗體，MS磁珠分選柱、LD磁珠分選柱。

1.3 主要儀器 流式細胞儀:美國BD FACS Calibur;超靜工作臺:新加坡ESCO;倒置顯微鏡:日本OLYMPUS CKX-31;二氧化碳恒溫培養箱:國產上海博訊HH.CP-01A;低溫冷凍臺式離心機:國產湖南賽特湘儀TGL-20 m;免疫磁珠磁力架、MidiMACS分選器和MiniMACS分選器:德國MACS Miltnyi Biotec。

1.4 實驗方法

1.4.1 孕鼠脾臟研磨與脾細胞懸液制備 孕鼠懷孕第9天頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡3 min，將孕鼠置于無菌紙上，左腹側朝上，放于無菌超凈臺中;在孕鼠左腹側中部剪開孕口，撕開皮膚，暴露腹壁，可見紅色長條狀脾臟;在脾臟下側提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪無菌分離脾臟下面的結締組織，取出脾臟，放入盛有5 ml Hank's液的培養皿中;制備脾細胞懸液:篩網研磨法:將脾臟放置篩網上，用2 ml注射器針芯輕輕研壓脾臟，獲細胞懸液;收集制備好的脾細胞懸液，1800rpm 4℃離心8 min;棄上清，重懸細胞，加5 ml ELS(紅細胞裂解液)，混勻，室溫靜置5 min;加Hank's液至10 ml，混勻，1800 rpm 4℃離心8 min;棄上清，加Hank's液至10 ml，混勻，篩網過濾，1800 rpm 4℃離心8 min，棄上清;5 ml RPMI 1640 重懸細胞;計數:190 μl臺盼蘭 +10 μl細胞懸液，混勻，取10 μl滴于計數板上，計數2個相對大方格內的細胞總數，并調整細胞濃度到108mol/L。

1.4.2 免疫熒光抗體標記及磁珠分選 磁珠陽性分選CD+4T 細胞:1 ×108個細胞用100 μl的1640 重懸，加入10 μl CD4-FITC，混勻，4℃ ～8℃孵育 15 min，再加入 1 ml RPMI，混勻，1000 r/min離心10 min，棄上清，重懸于80 μl的1640中。細胞懸液中加入40 μl CD4磁珠，混勻4℃ ～8℃孵育20 min，buffer洗滌后1000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀，用500 μl buffer重懸。將LD磁珠分選柱置于分選器中，2 ml buffer過柱，然后將細胞懸液加入其中，收集從分選柱中流出的細胞，得到CD4+細胞。

磁珠陽性分選CD+CD+T細胞和陰性分選CD+CD-425425T細胞:計數從分選柱中流出的CD4+T細胞，調細胞濃度，得量為 1 ×107個細胞。用 90 μl buffer重懸，加入 10 μL CD25磁珠，混勻，4～8℃孵育15 min，將MS磁珠分選柱置于分選器中，500 μl buffer過柱，然后將細胞懸液加入其中，用3 500 μl buffer洗柱，收集流下來的細胞懸液和洗柱液，此收集液即為CD4+CD25-T細胞，留作轉化實驗用。然后將柱子放入收集管中，移開磁場，向柱子中再加入1 ml buffer，用塞子快速將磁珠標記的CD4+CD25+調節性T細胞沖出柱子。

細胞計數:190 μl臺盼蘭 +10 μl細胞懸液，混勻，取10 μl滴于計數板上，計數2個相對大方格內的細胞總數。觀察細胞存活率。細胞存活率計算公式如下:細胞存活率=染色陰性細胞數/細胞總數100%。

1.4.3 流式細胞儀檢測 取1 105個細胞用抗CD4-FITC、抗CD25-PE的抗體雙色標記，室溫避光孵育30 min后，用PBS液洗滌重懸，上流式細胞儀檢測分選的CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25-細胞T的純度。

2 結果

流產模型孕鼠脾臟細胞經過多次免疫磁珠細胞分選法兩步分選得到CD4+/CD25

+調節性T細胞純度為(93.51.1)%，T細胞純度為(96.60.6)%，如圖1、圖2。

圖1 分選后的調節性T細胞，CD4+/CD25+

圖2 分選后的CD4+/CD25-細胞

3 討論

CD4+CD25+調節性T細胞(Treg細胞)是一類具有調節功能的T細胞群體，其可能通過抑制CD4+/CD8+T細胞，B細胞增生，抑制抗原提呈細胞(APC)，如子宮樹突狀細胞(uDCs)和單核細胞成熟，抑制子宮NK細胞的細胞毒作用，以及Ig、細胞因子的產生等來維持母體對孕體的免疫耐受［3］，Zenclussen 等［4，5］發現自然流產模型小鼠中 Treg 細胞在數量和功能上比正常妊娠模型小鼠都顯示有一定程度的下降，妊娠誘導的Treg細胞在母胎耐受中起到了至關重要的作用，由于該類細胞調節免疫的機理尚未得到完全闡明，因此分離、培養和擴增Treg細胞，已成為目前研究母胎免疫耐受的重要內容之一。

實驗中如何獲得大量Treg細胞是進行研究的前提條件。我們采用密度梯度離心法，從孕鼠脾臟組織中分離外周血單個核細胞，包括淋巴細胞、少量的單核細胞、中性粒細胞及混雜的紅細胞和血小板。其原理是利用各種細胞大小、密度、表面電荷、黏附能力等的差異進行分離［6］，本實驗采用小鼠淋巴細胞分離液作為分離純化試劑。

對于用于體外擴增的Treg細胞，目前常用的分選方法是免疫磁珠分選和流式細胞分選。免疫磁珠分選一般用CD4、CD25抗原作為分選標記來純化小鼠的Treg細胞，其原理是將包被有關抗體的磁珠與待分離細胞充分作用，這樣借助于抗體磁珠，將與相應的細胞結合成:細胞-抗體-磁珠復合物，該細胞在磁場中運動與其他細胞產生明顯差別。如采用層析的方法，將層析柱放于強磁場中，與磁珠結合的細胞運動將受限，而未與磁珠結合的細胞將先被洗脫下出來，再將該柱移出磁場，與結合的細胞也將被洗脫下來，達到分離目的。

免疫磁珠分選和常用的流式細胞分選相比，具有快速、高效、對靶細胞的活性和功能干擾少的優點，流式細胞分選雖然可以同時對2個甚至更多的CD熒光抗體標記信號一次性進行分選，分離純度高，但分離速度慢，細胞最終獲得率低，對細胞損傷較大，對于功能性的表面分子有激惹作用。綜合看來，我們采用免疫磁珠兩步分選來得到調節性T細胞和T細胞，對于孕鼠脾臟淋巴細胞的分離純化，取得較好的分離效果，細胞純度和活性均較高，為通過流產模型孕鼠(和正常對照)來進行復發性自然流產的相關性研究提供了方法學基礎。

［1］Tafuri A，Alferink J，Moller P，et al.T cell awareness of paternal alloantigena during pregnancy.Science，1995，270(5236):630-633.

［2］邱麗華，林其德.調節性T淋巴細胞與原因不明復發性流產的相關性研究.中華婦產科雜志，2004，39(12):816-818.

［3］Zhao FX，Zhang YY，Liu RH，et al.Effect of CD86 blockage on the expressions of TGF-＆1，MMP-9，TIMP-3 and PAI-1 proteins and outcome of pregnancy in murine abortion-prone model.J Microbiol Immunol，2006，4(2):137-145.

［4］Zenclussen A C，Gerlof K，Zenclussen M C，et al.Abnormal T cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion:Adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+T regulatory cells prevents fet al rejection in a murine abortion model.Am J Pathol，2005，166(3):811-822.

［5］Zenclussen A C.T regulatory cells in murine pregnancy.J Repord Immunol，2005，65(2):101-110.

［6］張誠，陳幸華，張曦，等.不同明膠濃度及淋巴細胞分離液對人臍血源黏附細胞原代培養的影響.中國實驗血液學雜志，2008，16(6):1437-1441.