改良組織芯片技術(shù)在胃癌研究中的應(yīng)用及體會

劉銀華，張修穩(wěn)，盧林明，趙國海

(1.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 病理科，安徽 蕪湖 241001;2.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 急診外科，安徽 蕪湖241001;3.皖南醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

組織芯片(tissue chip，TC)是用大量組織標(biāo)本高密度排列而成的組織微陣列(tissuemicroassays)，即微縮組織切片。Kononen等［1］于1998年在Nature Medicine上首次報(bào)道了組織芯片這一高通量技術(shù)，在一張組織芯片上有序地固定著成百甚至上千個(gè)組織樣本，每個(gè)樣本為圓盤狀，直徑為0.6～2.0 mm。這樣的組織芯片可被用來做特定的分子分析如DNA、mRNA的原位分子雜交和蛋白的免疫組織化學(xué)染色等。作為一種新型生物芯片，該技術(shù)自問世以來，已經(jīng)在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等腫瘤的研究中廣泛應(yīng)用，本研究通過制備大規(guī)模胃癌組織芯片，探討組織芯片制作方法的優(yōu)化以及其在胃癌組織中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 調(diào)取皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院胃腸外科2007年1月～2010年12月的胃癌手術(shù)病例，共1 235例，其中男性874例，女性361例，年齡42～79歲，平均(61.4±8.3)歲。

1.2 組織芯片的設(shè)計(jì)與制作

1.2.1 空白蠟塊制作 選取62～67℃純蜂蠟(上海華申康復(fù)器材廠)放入98℃溫箱內(nèi)融化1 h，棄去底部沉渣后用蠟塊制作模具制成長寬高為34 cm×24 cm×2 cm大小蠟塊。

1.2.2 受體蠟塊制作 首先我們用刻度尺和手術(shù)刀片在空白蠟塊上畫格，橫豎間距均為2.5 mm，距邊緣約2 mm;再應(yīng)用組織微陣列制作儀，在已畫好的方格內(nèi)打孔，制作成8×12陣列的受體蠟塊，每個(gè)微孔的直徑為1.2 mm，間距約為1 mm，深約3 mm(見圖1);本實(shí)驗(yàn)使用的組織微陣列制作儀系由北京博醫(yī)康醫(yī)療儀器有限公司所生產(chǎn)，該儀器配備有定位儀以及直徑分別為0.9 mm、1.2 mm、1.6 mm三種規(guī)格的打孔采樣針。本實(shí)驗(yàn)中，我們對定位方法進(jìn)行了優(yōu)化，使用在空白蠟塊上畫格定位的方法，舍棄儀器自帶的橫縱螺旋定位裝置。

1.2.3 供體蠟塊的取樣及點(diǎn)樣 首先用顯微鏡在HE切片標(biāo)記腫瘤組織，再根據(jù)HE切片上的標(biāo)記在供體蠟塊上選取相應(yīng)部位作為取材位點(diǎn)。使用組織芯片儀挖取點(diǎn)樣組織，依從左到右，自上而下的次序置入受體蠟塊內(nèi)。在每個(gè)受體蠟塊左上角的第一個(gè)孔內(nèi)置入肝組織作為標(biāo)記，同時(shí)記錄每個(gè)標(biāo)本在二維陣列中的具體位置(見圖2)。

1.2.4 融蠟 將含有標(biāo)本組織的陣列蠟塊底部墊上硬紙板，放入70℃的溫箱，加溫約20 min。由于純蜂蠟熔點(diǎn)較低，可較快溶解包裹組織芯，故融蠟時(shí)間不宜太長。建議初次融蠟時(shí)可每隔5 min看一次，以硬紙板上可看到液體石蠟輕微浸潤時(shí)為準(zhǔn)，取出切片，切片過程與常規(guī)組織切片基本相同。

1.3 免疫組織化學(xué)SP法 本次實(shí)驗(yàn)共成功制備胃癌組織芯片13枚，包含1 235例胃癌組織，隨機(jī)抽取1個(gè)組織芯片切片進(jìn)行免疫組化染色，用于與普通石蠟切片進(jìn)行對比，檢測制作效果。將普通石蠟切片與組織芯片蠟塊切片同一批進(jìn)行免疫組化染色，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，PBS液洗5 min×3次，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS液洗5 min×3次，高壓鍋抗原修復(fù)(修復(fù)液為0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，pH 6.0)，PBS液洗5 min×3次，滴加P16一抗工作液，4℃冰箱過夜，PBS洗5 min×3次，滴加二抗工作液，37℃孵育15 min，PBS洗5 min×3次，滴加卵白素過氧化物酶復(fù)合物，37℃孵育10 min，PBS洗5 min×3次，DAB 顯色劑顯色 7 min。以PBS液代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照(見圖3、4)。試劑鼠抗人P16多克隆抗體及S-P檢測試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.4 結(jié)果判定 P16陽性細(xì)胞染色定位于細(xì)胞質(zhì)，以胞質(zhì)中有淺黃、棕黃或棕褐色顆粒者為染色陽性，按染色強(qiáng)度判為淺黃(0分)、棕黃(1分)及棕褐色(2分)3級;按照陽性細(xì)胞比例分為＜10%(0分)、10% ～30%(1分)、31% ～60%(2分)及 ＞60%(3分)4級。總體評分值=陽性細(xì)胞比例評分×染色強(qiáng)度。評分:≤2分者判為陰性，3～6分者為弱陽性，＞6分者為強(qiáng)陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，采用配對χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片制作的改良

2.1.1 在制作空白受體蠟塊時(shí)，我們比較了在純蜂蠟中加入不同比例的普通石蠟，但最終還是認(rèn)為使用純蜂蠟較好，具體優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在以下三方面:①柔韌性好，有效地避免了打孔時(shí)開裂，而其他蠟塊在打孔時(shí)均出現(xiàn)了不同程度開裂，且打孔不受時(shí)間和室溫限制［6，7］;②可使微孔間距縮小至 1 mm 左右，最大程度地保證了在同樣大小的受體蠟塊上盡可能多地放入了樣本組織;③融點(diǎn)較組織芯石蠟低，有效包裹組織芯，避免了切片時(shí)組織芯的脫落。

2.1.2 制作受體蠟塊時(shí)，創(chuàng)造性地使用了蠟塊表面畫格法，相對于使用定位儀，畫格的方法加快了受體蠟塊的制作效率且各孔間分布更為均勻(見圖1～3)。本實(shí)驗(yàn)芯片制作速度明顯加快，且定位更加準(zhǔn)確、方便，微孔布局更趨合理，充分凸顯出組織芯片技術(shù)在大樣本檢測中的優(yōu)勢。

2.1.3 “二次點(diǎn)樣”:由于供體蠟塊過厚或過薄，常導(dǎo)致挖取的點(diǎn)樣組織厚度不一。本次實(shí)驗(yàn)處理時(shí)對于過厚的組織在用實(shí)心針芯緩緩?fù)瞥鰰r(shí)先用刀片酌量削去部分，對于過薄的組織則采用“二次點(diǎn)樣”，即在同一孔兩次置入同一供體組織，這樣既可以保證每孔內(nèi)含有足夠的待檢組織，又可以使組織芯的平面基本一致，利于制片。

本次實(shí)驗(yàn)我們隨機(jī)抽取制作的1張切片，所有芯片組織排列整齊，共96個(gè)組織位點(diǎn)，8個(gè)位點(diǎn)缺失，個(gè)別組織芯發(fā)生位移，不影響結(jié)果的判斷(見圖4、5)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色 1塊組織芯片88例胃癌組織中P16蛋白表達(dá)的陽性率為35.2%(31/88)，普通切片的陽性率為31.8%(28/88)，采用配對χ2檢驗(yàn)P=0.629，依據(jù)α=0.05的水準(zhǔn)，兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，提示組織芯片與普通免疫組化標(biāo)記結(jié)果基本一致。

表1 組織芯片與普通切片胃癌中P16蛋白的表達(dá)(n)Tab 1 The P16 protein expression detected by immunohistochemistry and tissue microarray technology in conventional sections from gastric cancer(n)

圖1 8×12陣列打孔后蠟塊Fig 1 8 x 12 Paraffin-embedded tissue block after micro-array drilling

圖2 8×12陣列組織芯片F(xiàn)ig 2 8 x 12 Micro-arrays of tissue chip

圖3 胃癌組織芯片HE染色Fig 3 Tissue micro-array for gastric cancer(HE staining)

圖4 胃癌組織芯片免疫組化染色Fig 4 Tissue micro-array for gastric cancer by immunohistochemical staining

圖5 普通胃癌組織切片免疫組化染色Fig 5 Tissue array slide of common gastric cancer tissues stained with immunohistochemistry

3 討論

TC也稱組織微陣列(tissue micro array，TMA)，是在單位面積的載體上，以微陣列的形式，按不同的設(shè)計(jì)要求，順序地放置數(shù)個(gè)到數(shù)百個(gè)乃至數(shù)千個(gè)集群標(biāo)本，包括集群細(xì)胞、組織、器官的樣本。作為一種新型生物芯片，該技術(shù)自1998年問世以來，已應(yīng)用于多種腫瘤的研究［1～5］，由于其具有高信息量、實(shí)驗(yàn)誤差小、標(biāo)本利用率高和成本低等優(yōu)點(diǎn)，又如同普通組織切片一樣，可以做HE、特殊組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)染色和原位雜交，故為尋找腫瘤基因、檢測生物試劑、質(zhì)控及標(biāo)準(zhǔn)化等方面的有效方法。本研究對組織芯片制作過程進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化后加快了其制作效率，凸顯出該技術(shù)在大樣本標(biāo)本檢測中的優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)中我們使用的蠟塊表面畫格法，即在空白受體蠟塊表面畫出大小均一的正方形方格，做到了行列間距的完全一致，使定位極為準(zhǔn)確且操作快速、簡單;同時(shí)，在空白的受體蠟塊的制作上，選用純蜂蠟作為原料，有效避免了脫片和開裂，且不受時(shí)間和室溫限制，省略了水浴恒溫的步驟，大大加快了受體蠟塊的制作速度，明顯優(yōu)于現(xiàn)有的儀器和方法。另外，“二次點(diǎn)樣”的應(yīng)用在很大程度上解決了個(gè)別供體蠟塊過厚或過薄的問題，使制片過程簡單化，同時(shí)確保了微孔內(nèi)含有足夠的待檢組織。在本實(shí)驗(yàn)中，兩張組織芯片切片中共有8個(gè)位點(diǎn)發(fā)生缺失，可能還是因?yàn)樵邳c(diǎn)樣過程中供體蠟塊較薄所致，最終導(dǎo)致點(diǎn)樣后組織芯沒有與受體蠟塊表面平齊，切片時(shí)難以將該位點(diǎn)有效切入。所以，除上述所介紹的“二次點(diǎn)樣”辦法外，還可以通過適當(dāng)增加切片張數(shù)來解決該問題。

p16基因定位染色體9q21，編碼相對分子質(zhì)量為16 ku的P16蛋白，特異性抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4和6活性，調(diào)控細(xì)胞周期，參與了人類多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，故又稱多種腫瘤抑制基因。多項(xiàng)研究［8～11］表明胃癌組織中存在p16基因啟動子區(qū)甲基化和P16蛋白表達(dá)降低，并與胃癌組織類型、分化程度及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)分別用兩種方法檢測P16蛋白在胃癌組織中的表達(dá)均在35%左右，這與我們前期的研究相一致［12］。兩種方法所測結(jié)果經(jīng)χ2檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明組織芯片與普通切片檢測結(jié)果基本一致。

綜上所述，此次改良組織芯片制作方法簡單、快捷，在保證質(zhì)量的同時(shí)，簡化了流程，降低了操作難度，提高了效率。且組織芯片具有普通切片無法比擬的優(yōu)越性:體積小、數(shù)量多、形狀規(guī)則，排列有序，檢測結(jié)果的科學(xué)性和可比性強(qiáng)，信息量大，效率高，消耗試劑少;可明顯提高實(shí)驗(yàn)效率、有助于減少實(shí)驗(yàn)誤差、有利于原始存檔蠟塊的保存，相信組織芯片技術(shù)必將在腫瘤的診斷和研究領(lǐng)域中發(fā)揮更加重要的作用。

［1］KONONEN J，BUBENDORF L，KALLIONIEMI A，et al.Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens［J］.Nat Med，1998，4(7):844-847.

［2］RUBIN MA，MUCCI NR，F(xiàn)IGURSKI J，et al.E-cadherin expression in prostate cancer:a broad survey using high-density tissue microarray technology［J］.Hum Pathol，2001，32(7):690-697.

［3］莊志剛，賀其志，蔣蓓琦，等.LKB1基因在不同基因亞型乳腺癌中表達(dá)的意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18(12):2363-2366.

［4］APARICIO LM，VILLAAMIL VM，GALLEGO GA，et al.Expression of Notch1 to-4 and their Ligands in Renal Cell Carcinoma:A Tissue Microarray Study［J］.Cancer Genomics Proteomics，2011，8(2):93-101.

［5］FERENC T，KOPCZY?SKI J，STALI?SKA L，et al.Minichromosome maintenance(MCM)and AgNOR proteins expression in desmoid tumours:a tissue microarray analysis［J］.Folia Histochem Cytobiol，2010，48(4):581-588.

［6］倪燦榮，李芳梅，朱明華，等.提高組織芯片切片成功率的方法和體會［J］.中華病理學(xué)雜志，2002，31(6):559-600.

［7］彭曉峰，楊清緒，范欽和，等.軟組織平滑肌肉瘤組織芯片的構(gòu)建及其在腫瘤標(biāo)志物研究中的應(yīng)用［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(1):14-16.

［8］ABBASZADEGAN MR，MOAVEN O，SIMA HR，et al.p16 promoter hypermethylation:a useful serum marker for early detection of gastric cancer［J］.World J Gastroenterol，2008，14:2055-2060.

［9］趙國海，李鐵臣，史良會，等.胃癌中p16基因缺失與突變的研究［J］.中國病理生理雜志，2002，18(5):543-545.

［10］趙國海，李鐵臣，孫惠蘭，等.胃癌中P16基因缺失的研究［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，20(2):83-85.

［11］ZHAO GH，LI TC，SHI LH，et al.Relationship between inactivation Of p16 gene and gastric carcinoma［J］.World Gastroenterol，2003，9(5):905-909.

［12］李鐵臣，蔣大平，盧林明，等.胃癌中p16蛋白表達(dá)和p16基因啟動子甲基化的研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2007，23(24):3812-3814.