組織蛋白酶B在肝星狀細胞HSC－T6中的動態表達和意義

李春艷 陳永平 申春燕

肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，在肝損傷過程中，肝星狀細胞增殖并向肌成纖維樣細胞分化，這一過程是可以逆轉的。肝纖維化的發病機制主要是肝星狀細胞的增殖和凋亡是否能達到平衡，若HSC的活化增加或其凋亡減少，都會導致肝纖維化的發生。因此抑制肝星狀細胞的活化與增殖、誘導其凋亡都會對肝纖維化過程起到預防和治療作用［1，2］。盡管近年來對這方面的研究很多，但具體的分子機制和調控過程還待進一步研究。

組織蛋白酶B(cathepsin B)是溶酶體內最重要的組織蛋白酶，屬于木瓜蛋白家族，廣泛分布于各種組織細胞的溶酶體中，主要降解各種組織蛋白。近年發現組織蛋白酶B除參與重要的生理功能外還與人類多種疾病如腫瘤的浸潤和轉移、關節炎、骨質疏松、多發性硬化癥、動脈粥樣硬化、腎纖維化、肺纖維化、肝纖維化、皮膚光老化等慢性疾病有關，因此備受關注［3～11］。

材料與方法

1．實驗材料及試劑:大鼠肝星狀細胞T6系，購自湖南湘雅醫學院細胞庫。胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養基購自美國Gibico公司;α－SMA鼠多克隆一抗購自美國Sigma公司;組織蛋白酶B兔多克隆一抗購自美國Santa cruz公司;組織蛋白酶B抑制劑(Z－FA－FMK)購自美國Santa cruz公司;磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)小鼠單克隆一抗、辣根過氧化物酶(HRP)二抗購自北京中衫公司;組織/細胞強效裂解液、BCA蛋白檢測試劑盒(購自上海碧云天生物技術研究所);RNA Iso試劑盒(購自大連寶生物公司)。

2．實驗分組及細胞培養:分對照組和抑制劑組，細胞培養至第3代時，以2×105接種到六孔板中，待細胞完全貼壁，對照組12、24、36、48h 的細胞只換培養液;抑制劑組 12、24、36、48h的細胞換培養液后分別加入26nmol/L的Z－FA－FMK。將凍存的HSC－T6細胞接種于含10%FBS的DMEM培養液中，置37℃ 5%CO2的培養箱中培養。當細胞貼壁生長鋪滿培養板的85%左右時，用0．25%胰酶消化后傳代，24h換液，72h再次傳代，每次試驗均在呈指數生長的細胞中進行。

3．Western blotting法檢測 cathepsin B、α －SMA:采用放射免疫沉淀測定(RIPA)組織/細胞強效裂解液抽提對照組和抑制劑組12、24、36、48h的 HSC－T6細胞總蛋白，用 BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，濃度測定后用裂解液進行配平，使得各時間點總的蛋白濃度相同。所有操作參照Western blotting實驗指南進行。cathepsin B和α－SMA一抗1∶800稀釋，內參GAPDH一抗1∶1000稀釋，小鼠抗大鼠辣根過氧化物酶標記二抗1∶5000稀釋，羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗1∶3000稀釋。底物增強型化學發光顯色，洗片顯帶，膠片掃描，用Gel－pro3．1軟件測量 cathepsin B、α －SMA 和 GAPDH的平均光密度，用cathepsin B、α－SMA與GAPDH的比值表示各蛋白的相對表達量。

4．RNA提取:采用RNA Iso試劑盒，按說明書提取HSCT6細胞總RNA。采用分光光度法測定提取的總RNA含量和純度，A260nm/A280nm比值在1．8～2．0范圍。

5．RT－PCR檢測cathepsin B mRNA、TGF－βmRNA和α－SMA mRNA:RT－PCR按鳥類成髓細胞瘤病毒(AMV)試劑盒按說明書操作。采用Premer5軟件設計引物序列，由上海捷瑞公司合成。TGF－β、α－SMA、cathepsin B與actin－β的PCR引物序列及反應條件見表1。PCR產物在1．5%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統掃描，用Gel－pro3．1分別測量TGF－β、α－SMA、cathepsin B、actin－β的平均積分吸光度。用TGF－β、α－SMA、cathepsin B與actin－β的比值來表示各自mRNA的相對表達量。

6．統計學方法:所有數據采用SPSS 17．0統計軟件分析，對計數資料進行正態性檢驗，計數資料用均數±標準差s)表示。樣本均數比較采用配對t檢驗進行分析。雙變量均服從正態分布的相關性討論采用Pearson直線相關分析，否則采用Spearman秩相關，p＜0．05表示差異有統計學意義。

表1 PCR引物序列及反應條件

結 果

1．倒置顯微鏡觀察結果:抑制劑組細胞12h后有細胞脫落，懸浮于上清中，隨時間的增加，上述情況有所改善。較對照組細胞明顯減少，細胞間隙較寬，細胞皺縮，核染色質濃集呈球形，見圖1A。對照組HSC－T6細胞隨著時間的延長，形態和數量都有明顯的變化，12h時細胞形態不規則，呈圓形、梭形、三角形等，細胞數量較少;24h時細胞呈星形，星芒狀突起豐富，高倍鏡下細胞核呈圓形或不規則形，核仁圓形，清晰可見，細胞數量較多。對照組24h細胞呈肌成纖維細胞樣細胞(myofibroblast－ like cell，MFB)外形，未見到核染色質濃集，見圖1B。

圖1 對照組和抑制劑組各時間點的細胞生長狀態

2．Western blotting印跡法檢測 cathepsin B、α －SMA結果:HSC隨著培養時間的延長，向成纖維肌樣細胞轉化，在培養過程中不同時間點cathepsin B的表達也不同，結果顯示，對照組隨著時間的延長cathepsin B的表達增加，進一步說明cathepsin B參與了HSC的增殖和分化;抑制劑組在加入組織蛋白酶B抑制劑 Z－FA－FMK后由 cathepsin B表達量(0.49±0．04)較對照組(0．68 ±0．09)明顯減少，差異具有統計學意義(t= －6．31，P ＜0．05)，說明 Z －FA－FMK能有效抑制cathepsin B蛋白的表達，見圖2、圖3。實驗結果還發現α－SMA的變化趨勢與cathepsin B的變化趨勢相平行。α－SMA作為HSC向肌成纖維細胞轉化的標志，對照組隨時間的延長α－SMA的表達量增加;抑制劑組在加入Z－FA－FMK 12、24、36、48h 后，α － SMA 的表達量(0．64 ±0．03)較對照組(0．79±0．01)有所降低，差異具有統計學意義(t= －6．18，P ＜0．05)(圖 2、圖3)。

3．RT－PCR 檢測 cathepsin B mRNA、TGF－β mRNA和α－SMA mRNA結果:對照組cathepsin B mRNA的表達量隨著時間的延長而增加，抑制劑組cathepsin B mRNA 的表達量(2．00±0．11較對照組(2．24±0．47)有所下降，且差異具有統計學意義(t=－3．41，P ＜0．05)。對照組 TGF－β mRNA 隨著時間的延長表達量增加，抑制劑組TGF－βmRNA的表達量(1.43 ±0．16)較對照組(1．81 ±0．21)有所減少，且差異具有統計學意義(t=6．44，p＜0．05)。對照組α－SMA mRNA隨著時間的延長表達量增加，抑制劑組α－SMA mRNA的表達量(0．40±0．06)較對照組(0．81±0．08)有所減少，且差異具有統計學意義(t=－4．28，P ＜0．05)(圖 4、圖 5)。

4．相關性分析:cathepsin B與α－SMA的表達量呈正相關(蛋白水平:r=0．97，P ＜0．05;mRNA 水平:r=0．84，P ＜0．05)，說明 α －SMA 的表達量的變化與cathepsin B表達量的變化平行。

討 論

肝纖維化是肝臟對各種病因所致的慢性肝損傷的一種修復反應，其實質是以膠原分泌為主的細胞外基質(ECM)的過度沉積，HSC在肝纖維化進程中起關鍵作用，是肝纖維化時ECM合成的主要來細胞。TGF－β是調控肝纖維化發生發展的核心因子，以表達α－SMA為標志的活化的肝星狀細胞(HSC)是肝內ECM的主要來源

組織蛋白酶B是主要的溶酶體蛋白酶，腫瘤的發生和轉移歸因于廣泛的細胞外基質重塑和細胞死亡途徑的調控［4］。盡管已有研究證明組織蛋白酶參與肝纖維化形成，但它們在HSC生物性調控和纖維形成中的作用還不清楚［8，10］。本實驗研究結果顯示，組織蛋白酶B參與了HSC的增殖和分化;同時還發現α－SMA的變化趨勢與組織蛋白酶B的變化趨勢相平行。證明了HSC隨著培養時間的延長會向成纖維肌樣細胞轉化，抑制cathepsin B的活性能夠減緩或抑制HSC的增殖以及向成纖維肌樣細胞轉化，為組織蛋白酶B在肝纖維化發病機制中的作用提供了依據。

Okuyama的研究顯示分泌的CTB可下調PDGFβR，使 PDGF不能誘導靜止期 HSC 的增殖［12］。Anna Moles所做的研究顯示組織蛋白酶B通過異常的機制能直接調控HSC增殖［10］。組織蛋白B的遺傳和藥理性拮抗作用都能抑制活化的鼠HSC或永生的人Lx2細胞。而不是通過調節降低PDGFβR對與其配對的PDGF，組織蛋白酶的抑制通過PDGF影響AKT的磷酸化。這些研究結果顯示組織蛋白酶B確實通過PDGF調控PI3K/AKT途徑。PDGF在體外激發后cathepsin B活性的缺失后AKT的活化減低的確切機制和參與這一過程的主要蛋白是今后最重要也是最有價值的研究。

組織蛋白酶和內涵體早晚期的標記共區域化顯示溶酶體組織蛋白的釋放是隨著分泌途徑來調節ECM成分和質膜HSC受體的［10］。本實驗研究顯示，在HSC－T6細胞培養過程中，cathepsin B的表達量隨時間的延長而增加，Z－FA－FMK作用后cathepsin B的表達量較對照組有所減少，且差異具有統計學意義。此外，cathepsin B防止HSC增殖，下調負性調控HSC活化的表型標志物的表達，如A－SMA，TGF－β。本實驗研究還表明cathepsin B的變化趨勢與肝纖維化常用指標TGF－β和α－SMA表達量的變化趨勢一致，且較對照組明顯減少。這些結果都顯示半胱氨酸組織蛋白酶直接調控HSC活化后早期轉分化和永生化，是調控他們潛在纖維化和最終肝纖維化的關鍵。然而，Anna Moles等發現在原始小鼠HSC中TGF－β的表達減少，TGF－βmRNA的表達的水平在LX2細胞中沒有變化，表明這些細胞比5天的小鼠HSC更加分化，并且在這一分化階段TGF－β的調控可能不同［13，14］。本實驗研究顯示HSC－T6細胞TGF－β的表達量隨時間的延長而增加，但抑制劑作用后TGF－β與TGF－βmRNA的表達量都較對照組有所降低，且差異具有統計學意義。

許多文獻顯示在炎癥過程中組織的局部會出現PH的降低，有利于分泌的組織蛋白酶的活化。事實上，組織蛋白酶的分泌和許多腫瘤實質的侵襲和轉移都有關，說明組織蛋白酶B通過降解ECM成分或激活其他基質降解蛋白如尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑來促進侵入［3，15］。假如組織蛋白酶 B對活化的HSC的增殖和纖維形成有作用，我們將進一步研究他們對體內肝纖維化的影響。之前Canbay在膽道結扎的肝纖維化模型中的研究認為組織蛋白酶B參與了肝臟的膽汁淤積引起的炎癥、細胞凋亡、最終導致肝纖維化形成，敲除CTB基因或用CTB藥物抑制劑后大鼠肝臟炎性損傷及纖維化形成減輕［9］。

Anna Moles分析了cathepsin B在CCL4誘導的肝纖維化模型中的作用［10］。Anna Moles所做的研究顯示對cathepsin B進行藥理學抑制能防止α－SMA的增加、膠原合成和CCl4誘導引起的中性粒細胞的侵潤。組織蛋白酶抑制劑不能改善由CCl4導致的肝損傷，反映了組織蛋白酶B與肝細胞損害有刺激依賴性［7，16］。此外，CCl4作用在 HSC 后 cathepsin B 的表達量增加，在肝細胞中未被檢出，由組織蛋白酶活性的生化檢查和GFAP染色法，我們不能排除cathepsin B參與肝臟其他成肌纖維細胞樣細胞群。

cathepsin B參與了人類多種重要的生理功能及病理進程，本實驗研究證明cathepsin B調控HSC的增殖和分化，它的抑制劑可以下調纖維化指標α－SMA、TGF－β的表達，進而參與了肝纖維化形成過程，這一研究為進一步探索肝纖維化形成的機制提供了理論基礎，cathepsin B可作為今后治療肝纖維化治療的靶點。

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