CACNB2基因多態性與鈣離子通道阻滯劑降壓療效的相關性研究

李清賢 孫 倩 宋喜發 唐疾飛 王堯杰 牛宇欣 包其郁 張國強 胡云良

原發性高血壓是一種多基因遺傳性疾病，由多對等位基因(共顯性基因)控制，并受環境因素影響，是心腦血管疾病的主要危險因素。鈣離子拮抗劑(CCB)作為臨床治療高血壓病的一線藥物，是一種公認的有效抗高血壓藥和動脈擴張藥，它通過阻滯Ca2+進入細胞內特異性L型Ca2+通道而發揮作用［1］。但不同EH患者群體及個體對CCB呈現不同的降壓反應，推測可能與遺傳素質的不同有關［2］，本實驗選取CACNB2的6個SNP位點，選擇服用單一鈣離子通道阻滯劑(CCB)的EH患者進行臨床跟蹤隨訪觀察療效，旨在探討CACNB2基因多態性與CCB降壓療效的相關性。

對象與方法

1．實驗對象:于溫州醫學院附屬第二醫院、鹿城區人民醫院以及溫州市部分街道衛生服務中心，隨機選取104名EH患者，按照2004年《中國高血壓防治指南》高血壓診斷標準:未治療前非同日3次測量，收縮壓≥140mmHg和(或)舒張壓≥90mmHg者，或者血壓＜140/90mmHg，但正在服用降壓藥者。男性60例，女性44例，平均年齡47．39±9．42歲。并排除繼發性高血壓、糖尿病、活動性甲狀腺功能亢進、貧血、周圍血管疾病、大動脈炎、先天性血管畸形，排除不適合服用CCB患者。且所有研究對象簽署知情同意書入選。

2．研究方法:(1)用藥方法:對診斷發現的原發性高血壓病例服用納欣同(浙江泰利森藥業有限公司生產，批號:090404)20mg，每日1次。之前正在服用其他降壓藥物治療的病例需在入選后停用原降壓藥物2周之后服用納欣同。在每一天的同一時間段服用，期間不用其他任何影響血壓的藥物。(2)觀察指標:服藥前及服藥后的第2、4、6周末各隨訪1次，按照血壓測量的標準方法由專人在固定時間段測量血壓值，并做以記錄。(3)療效判斷標準:治療6周末，收縮壓降低值大于等于20mmHg，舒張壓降低值大于等于10mmHg，或者未達到上述標準，但是降至正常范圍，均視為治療有效。(4)標本的采集:治療前空腹抽取靜脈血5ml，2ml入EDTA抗凝管中，－70℃低溫儲存，以備用于標本統一提取基因組DNA，3ml用于分離血清檢測血脂、血糖、肝腎功能等生化指標。

3．基因擴增及分型:(1)儀器與試劑:Applied Biosystems公司的GeneAMPPCR System9700;MassARRAY Compact System;人血全基因組DNA抽提試劑盒購血AXYGEN公司，多重PCR引物及延伸引物由SEQUENOM公司Assay Design3．1程序進行設計由北京擎科公司合成，PCR引物及延伸引物序列(表1)。(2)PCR及SNP分型:利用多重PCR技術對目的序列進行擴增，采用多重PCR技術對所選的6個包括SNP位點在內的基因序列進行擴增。(按800個標本配制PCR反應Mix，加入6對引物，每一個標本對應的孔反應體系:總體系5μl中含:10ng/μl的 DNA 2μl;Buffer 0．5μl;25mmol/L MgCl20．4μl;25mmol/L dNTPMix 0．1μl;0．5μmol/L Primer Mix 1μl，5U/μl PCR Enzyme 0．2μl，剩余加去離子水 0．8μl至 5μl。反應條件:95℃預變性2min，95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，45個循環，最后72℃延伸5min)在上述PCR擴增產物中加入ddNTP，通過單堿基延伸只能延伸一個堿基(約20bp)對目的SNP位點進行延伸(反應體系:iPLEX GOLDBuffer 0.2μl;iPLEX Termination mix 0.2μl;iPLEX Enzyme 0.041μl;iPLEX Extend Primer Mix 0.94μl;iPLEX GOLD Buffer 0.2μl;Nanopure water 0．619μl;共 2μl加入至上一步的體系中共9μl，反應條件:①94℃預變性 30s;②94℃變性5s;③52℃退火5s;④80℃延伸5s;③④循環5次;然后②③④循環40次;⑤94℃ 延伸5s。)產物通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI－TOF MS)基因分型技術，進行SNP分型。

表1 CACNB2基因6個SNP位點的PCR延物及單堿基延伸產物設計

4．統計學方法:應用SPSS 16．0統計分析軟件，群體代表性檢驗采用Hardy－Weinberg平衡法;概率用P表示，p＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1．質譜分析結果:根據單堿基延伸產物分子質量不同確定其基因型，經MALD1－TOF檢測分析，在6個位點中，除rs7069292在人群中只發現兩種基因型TT和CT，其余5個位點均發現3種基因型均可得到3種質譜圖形(兩種純合型和一種雜合型)單峰為純合型，雙峰為雜合型。以rs10764319 C/T多態性的質譜圖為例作說明(圖1)。

圖1 rs10764319 C/T多態性的質譜圖

2．群體代表性檢驗:高血壓患者和血壓正常者CACNB2基因的6個SNP位點基因型分布經χ2檢驗，P＞0．05，符合 Hardy－Weinberg平衡，表明研究對象來自同一群體具有群體代表性。

3．服用鈣拮抗劑者各個位點不同基因型療效的差異(104例):對服用單一鈣拮抗劑隨訪6周到底的104例EH病例進行病例自身對照研究，經R×C表卡方檢驗和四格表卡方檢驗，結果顯示，rs11014166 SNP攜帶AA基因型的病例對鈣拮抗劑有效率顯著高于AT+TT基因型攜帶者的有效率，統計學意義差異顯著(p＜0．05)，其余5個位點各基因型之間均無統計學意義(P均＞0．05)(表2)。

討 論

鈣離子通道分為三型:L型、N型、T型，其中L型最重要，主要分布在血管平滑肌和心肌，L型電壓依賴性鈣離子通道(L－VDDC)包括α1、α2δ和β亞單位。其中α1亞基最重要，由它組成親水孔道調控Ca2+內流。Ca通道藥理學、電生理學的差異主要取決于α1亞基的種類［3］。相關動物實驗研究表明，人為地使機體動脈血壓升高，可使α1C亞基上調，鈣離子通道數目增多，提示血壓與鈣離子通道數目也呈正相關［4］。輔助亞基β2(CACNB2)編碼電壓門控離子通道β2亞基，定位于染色體10p12［5］。主要通過與α 亞基結合調節 L－VDDC 活性［6～10］。改變 Ca2+內流的數量，影響α1亞基的功能。α1亞基在高血壓時表達增加，使鈣通道數量增多，從而加速高血壓的發展，故能使α1C亞基數目恢復正常的藥物，有望用于臨床治療高血壓。鈣離子拮抗劑通過與鈣離子通道靶位點結合，抑制鈣離子通道活性，從而抑制鈣離子從膜外向膜內內流，降低細胞收縮，導致血管擴張，從而達到降低血壓的目的。

表2 服用鈣拮抗劑者各位點不同基因型療效的差異(n=104)

我們的研究通過對104例隨訪6周觀測血壓變化的EH病例進行CACNB2基因型高血壓關系分析，結果發現rs11014166攜帶AA基因型鈣拮抗劑有效率顯著高于AT+TT基因型攜帶者，統計學差異顯著(p＜0．05)，rs11014166的基因AA基因型對鈣拮抗劑比較敏感，降壓效果較其他兩種基因型明顯，推測rs11014166位點多態性可能影響鈣拮抗劑對EH療效，該位點位于內含子區域，推測可能通過影響轉錄過程，影響到基因的表達改變，進而影響蛋白質的功能，導致β2與α1亞基結合改變，致使L－VDCC活性改變，從而導致血壓的變化。我們可以推測，CACNB2多態性位點的突變，可能會通過影響CACNA1C的功能調節，或直接影響L－VDCC的功能，進而影響到其與靶位點結合，導致鈣拮抗劑藥物療效出現差異。另外近來藥物學方面的研究，設計出的一種變異的β亞基，通過它影響α1C亞基，進而影響鈣離子通道數目減少鈣離子的內流，影響興奮收縮偶聯。其利用Ca2+v1．2的變異，或利用變異的β或α2δ亞基，后兩亞基自身結構改變或者與α1亞基結合改變影響其對血管上的α1C亞基的調節，間接的特異的減少血管上L型鈣通道的數量，設計出新型的降壓藥物［11］。其余5個SNP位點治療療效在每個位點的不同基因型間的差異無統計學差異，可能是因為樣本量少，抽樣誤差造成，同時部分位點的部分基因樣本含量太少，或許并不能真實反應相應攜帶者的實際藥物反應水平，還需進一步擴大樣本量，做進一步的研究來驗證。

本研究首次在國內探討了鈣離子通道輔助亞基CACNB2多態性對鈣拮抗劑治療EH患者療效差異，為EH臨床個體化有效用藥提供藥物遺傳學依據。

1 Znirten V．原發性高血壓藥物治療的新進展［J］．高血壓雜志，2002，10(5):405

2 Lifton RP．Genetic determinant of human hypertension［J］．Prroc Natl Cad Sci USA，1995，92(19):8545 －8451

3 張朝，翟溯瀾．心肌細胞L型鈣離子通道分子結構與疾?。跩］．河南大學學報(醫學版)，2007，26(3):1 －6

4 薛全福，王振綱．鈣通道不同分型與亞基和抗高血壓藥物的關系［J］．中國藥理學通報，2008，24(5):569 －572

5 Ebert AM，McAnelly CA，Srinivasan A，et al．The calcium channel β2(CACNB2)subunit repertoire in teleosts［J］．BMCMolecular Biology，2008，9:38

6 Varadi G，Lory P，Schultz D，et al．Acceleration of activation and inactivation by theβsubnit of the skeletal muscle calcium channel［J］．Nature，1991，352:159 －162

7 Lory P，Varadi G．Schwartz A．Theβ subunit controls the gating and dihydropyridine sensitivity of the skeletal muscle Ca2+channel［J］．Biophys J，1992，63:1421 －1424

8 Kldckner U，Itagaki K，Bodi I，et al．β subunit expression is required for cAMP－dependent increase of cloned cardiac and vascular calcium channel currents［J］．Pflagers Arch，1992，420:413 －415

9 Singer D，Biel M，Lotan I，et al．The roles of the subunits in the function of the calcium channel［J］．Science，1991，253:1553 － 1557

10 Wei X，Perez－Reyes E，Lacerda AE，et al．Heterologous regulation of the cardiac Ca2+channel，subunit by skeletal muscle β andγsubunits［J］．JBiol Chem，1991，266:21943 －21947

11 Sonkusare S，Palade PT，Marsh JD，et al．Vascular calcium channels and high blood pressure:pathophysiology and therpeutic implications［J］．Vascul phamacol，2006，44(3):131 －142