人源化乙肝表面抗體重鏈克隆、表達及免疫學特性初步鑒定

王曄愷 周吉航 周世權 曾 芳 黃燕燕 劉曉光

血源性乙肝疫苗在我國經數十年近億人次的接種，雖從總體來說具有良好的安全性和免疫原性，但對小部分使用者如新生兒等群體仍存在異源性致敏的風險［1］。隨著DNA重組技術的進展，出現了鼠單抗、小分子抗體等各種重組乙肝表面抗體，但與天然的人抗體分子相比，小分子抗體結構不完整無法發揮Fc段介導的各種生物學效應，而鼠單抗則不能完全消除抗體的異源性，親和力也低。因此，本研究針對以上的問題，通過流式分選得到抗體分泌細胞(antibody-secreting cells，ASC)群，建立起一種利用單細胞RT-PCR克隆并表達得到能與乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)特異性結合的人源化乙肝表面抗體(hepatitis B surface antibody，HB-sAb)重鏈，為人源化、個體化的乙肝治療性抗體開發提供理論和實驗依據。

對象與方法

1．研究對象:選取健康志愿者8名，無各種器質性和免疫性疾病史，未接種過乙肝疫苗，乙肝三系各項檢測均為陰性(放射免疫法)，對志愿者注射乙肝疫苗(基礎免疫3針)，完成第3針注射后的第30日清晨各志愿者均空腹抽血20ml，以枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝，每份樣本取2ml全血3000r/min離心取500μl血漿檢測其HBsAb濃度(放射免疫法)，篩選得到HB-sAb＞1000mIU/ml的樣本1份。

2．單細胞分選:將篩選出的HBsAb＞1000mIU/ml的血樣(放免儀器為雅培i2000型，乙肝三系定量檢測試劑盒為配套試劑)用 Ficoll液(CEDARLANE-H-CL5020)分離，吸取500μl單個核細胞層懸液，PBS洗滌3次，吸棄上清，加CD3-FITC、CD20-FITC、CD38-PE、CD27-PC5、CD19-APC 各 20 μl(貝克曼-庫爾特)，振蕩混勻，避光靜置20min后，加200μl PBS，標本置流式細胞儀(BD FACSAria高速分選型)上，依次選取 R1→R2→R3門，得到 R1＆R2＆R3細胞群(CD19+/CD20-＆CD3-/CD27high/CD38high)，用調試用96孔板(Axygen公司)確定液滴中心位置，開啟這群細胞的分選，每孔一個細胞，分選多板(圖1)。分選結束后加蓋并取出微孔板，顯微鏡(Olympus BX60)下計數并記錄有單個細胞的孔號。

3．乙肝表面抗體重鏈克隆:單細胞RT-PCR模板制備:在顯微鏡下觀察到有單個細胞的微孔中每孔加入1%的NP40(碧云天生物技術研究所)5μl，42℃孵育 20min，再加 AMV 0．5μl，45℃孵育45min，然后分兩等份，分別用于重鏈部分全長片段和全長片段的克隆。

采用巢式PCR克隆重鏈部分全長片段:取單細胞RT-PCR模板，第1輪PCR加Access Quick Master mix(2×)(Promega 公司)12．5 μl，dNTPs(10mmol/L each)0．5μl，重鏈部分全長片段5'-隨機引物(天根生化)和3'-外側引物(5'-aaggtgtgcacgccgctggt-3')各 0．5μl(終濃度為 0．6μmol/L)，加ddH2O 補足 25μl，PCR 條件為 95℃ 15min;95℃ 1min，55℃1min，72℃ 1min，30 個循環;72℃ 10min;4℃ 5min。第 2 輪PCR加第一輪 PCR 產物 2μl為模板，2 ×PCR buffer12．5μl，重鏈部分片段5'-隨機引物和3'-內側引物(5'-cggttcggggaagtagtcct-3')各 1μl(終濃度為 0．6μmol/L)，PCR 條件均為:95℃ 5min;95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，35 個循環;72℃5min，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳。

4．重鏈部分全長PCR產物純化和鑒定:產物切割，用DNA膠回收純化試劑盒(Promega公司)純化，克隆到T載體，挑取20個白斑搖菌，送至中國科學院北京基因組研究所測序。

5．重鏈全長克隆:取“單細胞 RT-PCR 模板”5μl，重鏈全長引物 5'端引物(5'-atcagatctatggctagt gggaggtgggc-3')0．5μl(終濃度為 1μmol/L)，3'端引物 0．5μl(5'-atcaagctttcatttacccggagaca ggga-3')(終濃度為 1μmol/L)，10 × buffer 5μl，dNTP(25mmol/L)2μl，LA taq 0．5 μl，補 ddH2O 到 25μl。擴增條件為 95℃ 5min;95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，35 個循環;72℃10min，擴增產物經0．8%瓊脂糖凝膠電泳。產物經膠回收后，雙酶切克隆到pEGF-N1成為pEGFP-IgG(H)質粒，并送中國科學院北京基因組研究所測序驗證。

6．pEGFP-IgG(H)轉染:pEGFP-IgG(H)質粒經 LipofectAMINETM試劑盒(Life Technologies公司)轉染到COS-7細胞，培養72h，取上清4000r/min離心10min，棄沉淀。

7．IgG(H)結合特異性驗證:HBsAg(北京生物制品研究所)用1×SDS稀釋到10μg/ml，用PCR儀煮沸10min變性，每孔10μl上樣，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白(15%分離膠，5%濃縮膠)，轉移至PVDF膜上(300mA，30min)，5%脫脂牛奶封閉非特異抗原2h，按照蛋白質marker切割PVDF膜，并分別加入1∶50稀釋的上清，4℃過夜。PBS-T洗滌3次，每次10min。再分別加入1∶1000稀釋的羊抗人 IgG-HRP(Santa Cruz)，室溫震搖1h，PBS-T洗滌3次，每次15min。ECL系統顯色，凝膠成像儀(BIO-RADUniversal HoodⅡ型)下攝片，采用Quaintity one分析軟件進行條帶分析。

8．IgG(H)親和力檢測:親和力常數(ka)測定參照Batty飽和法［2］，將 HBsAg溶解在 5μg/ml的碳酸鈉緩沖液中，室溫包被在96孔板中過夜，PBS-T洗3次，將不同濃度IG(H)上清加到96孔板中，孵育1h，洗去后加HRP標記羊抗人IgG二抗，TMB顯色試劑盒顯色后置酶標儀450nm波長下讀取數據。

結 果

1．重鏈部分全長PCR產物電泳:條帶約在480bp左右，將其條帶回收后克隆到T載體(圖2)。

圖2 重鏈部分全長電泳

2．重鏈部分全長序列分析:20個白斑搖菌所得的20個序列在NCBI數據庫經Blast分析，15個克隆全長在600bp～1kb，剩下的5個克隆中有3個是序列相同的克隆，另外2個也是IgG重鏈的序列，本研究中我們只選取了相同序列的3個克隆進一步設計全長引物擴增其全長。

3．重鏈全長 PCR產物電泳和測序:條帶約在1500bp左右，與預期長度相符，經測序分析重鏈全長基因ORF序列與NCBI數據庫中的XP_002348298 95%同源，其Acession number為igg_heavy HQ829365(圖3)。

圖3 重鏈全長PCR產物電泳

4．IgG(H)結合特異性檢測:Western blotting顯示，pEGFP-N1上清液孵和pEGFP-N1上清液加入10μgHBsAg后孵育均無目的條帶，而 pEGFP-IgG(H)上清液孵育有較強的條帶，但pEGFP-IgG(H)上清液加入10μgHBsAg后條帶灰度降低較大，這說明上清液中加入的HBsAg與4d上的HBsAg競爭性地結合上清中的重鏈，從而造成4d上的條帶灰度降低(圖4)。

討 論

單克隆抗體自從20世紀70年代制備出來以后，在醫學、生物學、免疫學等諸多學科發揮了重要作用，在臨床上對于腫瘤等疾病也有一定的應用價值［3］，但治療性單抗目前存在的主要問題是多以鼠源為主，容易被人體免疫系統識別產生人抗鼠抗體而將其清除［4］。因此，單抗的人源化改造成為熱點，這是因為人源化改造后不但減少了機體的免疫排斥反應，而且人源化抗體中的Fc段能夠誘發機體效應細胞的殺傷作用［5］。

目前完全人源化抗體的制備方法主要通過抗體庫技術和轉基因技術，而我們通過流式分選和單細胞RT-PCR建立的這種從外周血ASC細胞中擴增乙肝表面抗體重鏈基因的技術，不但達到了完全的人源化，而且從理論上說可以針對個體制備出個體化的抗體，達到個體化治療的目的。由于ASC細胞目前的尚無共同認可的表面標記，Crotty等［6］認為人記憶性B細胞表面標記是CD19+CD20+Ig+CD27+，在受外界抗原刺激7天左右能達到外周血ASC細胞的2%左右，并通過酶聯斑點免疫法分離得到這群細胞。而本研究則采用Smith K等［7］報道所采用的 CD19+/CD20-＆CD3-/CD27high/CD38high這類組合進行篩選ASC細胞。并且單細胞RT-PCR的優點在于克隆出來的重鏈和輕鏈和來源于同一ASC細胞，通過連接肽(Gly4Ser)3連接配對后，構建出來的抗體可以和自然分泌抗體的分子結構達到高度的相似性，從而最大程度地發揮抗體的結合能力，這是一般重組技術和多細胞模板的RT-PCR無法做到的。

抗體的免疫學特性主要體現于抗原抗體反應的結合容量、親和力、特異性3方面，其中測定親和力Ka的方法有平衡透析法、Scatchard plot法和Batty飽和法等［8］，由于Batty飽和法簡單適用，因此本研究用了此法檢測IgG(H)的Ka值達到了2．39×109L/mol，而根據 James等［9］Ka為 107～1012L/mol為高親和力的理論，我們表達得到的IgG(H)親和力較高。在對抗體的特異性鑒定中一般使用交叉反應實驗，而本研究只通過設立多種對照初步地證明IgG(H)對HBsAg具有一定的結合力，提示此由此重鏈所制備得到的乙肝表面抗體非常可能具有清除乙肝病毒的能力，在職業暴露、產前阻斷等個體化預防和治療的應用領域有廣泛的前景。

1 Bulbul A，Karadag A，K?klü E，et al．Anaphylactic shock due to hepatitis B immunoglobulin in a newborn［J］．Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine，2010，23(10):1257-1259

2 Batty JD，Beatty BG，Vlahos WG．Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay［J］．J Immunol Methods，1987，100(1-2):173-179

3 Arlen M，Arlen P，Tsang A，et al．The therapeutic value of monoclonal antibodies directed against immunogenic tumor glycoproteins［J］．J Cancer，2010，1:209-222

4 Goto M，Kuribayashi K，Umemori Y，et al．High prevalence of human anti-mouse antibodies in the serum of colorectal cancer patients［J］．Anticancer Res，2010，30(10):4353-4356

5 王業榮，童德文，李立，等．人源化抗體制備及其應用研究進展［J］．生物技術通訊，2007，18(4):683-687

6 Crotty S，Aubert RD，Glidewell J，et al．Tracking human antigen-specific memory B cells:a sensitive and generalized ELISPOTsystem［J］．J Immunol Methods，2004，286(1-2):111-122

7 Smith K，Garman L，Wrammert J，et al．Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen［J］．Nat Protoc，2009，4(3):372-384

8 王自良，張改平，楊艷艷，等．抗苯巴比妥單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立及其免疫學特性鑒定［J］．核農學報，2006，20(4):336-340

9 James WG．Monoclonal antibodies:principles and practice［M］．Academic press，Inc Ltd，1983:142-147