骨髓瘤細胞誘導破骨前體細胞分化的分子機制探討

湯麗苑 俞 康

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是以骨髓微環(huán)境中漿細胞惡性增殖為特征的血液腫瘤．RANKL/核因子－κB受體活化因子(receptor activator of NF－κB，RANK)/護骨素(osteoprotegerin，OPG)與MM發(fā)病關系密切［1］。但目前國內外對 MM細胞本身是否表達RANKL仍未達成共識。本文著重研究人骨髓瘤細胞株RPMI8226能否表達 RANKL。通過 rhRANKL、條件培養(yǎng)液與RANKL mAb體外干預，從細胞水平和基因水平探討骨髓瘤細胞RPMI8226誘導RAW264．7細胞分化成熟的影響，從而進一步闡明骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)的分子機制。

材料與方法

1．主要材料:鼠單核吞噬細胞株(RAW264．7)購于北京協(xié)和醫(yī)科大學細胞庫。人骨髓瘤細胞株(RPMI8226)和人成骨肉瘤細胞株(MG－63)購于武漢大學細胞保藏中心。人抑制性RANKL單克隆抗體MAB6262，MAB6261(用于Western blotting)和rhRANKL購于R＆D公司。TRAP染色試劑盒購于Sigma公司。高糖DMEM培養(yǎng)基購買至GIBCO公司。Random Primer、反轉錄酶、Rnaisn、dNTP mix、5 × reaction buffer購于Fermentas公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。Platinum PCR Supermix購于Invitrogen公司。

2．工作液的配制:MAB6262、MAB6261干粉500μg用 1ml無菌PBS溶解，配成濃度為500μg/ml，分裝后 －80℃儲存。rhRANKL蛋白干粉10μg用0．2ml無菌PBS溶解，配成濃度為50μg/ml，加入0．1%人白蛋白保持其活性，分裝后－80℃儲存。

3．細胞培養(yǎng):RAW264．7、RPMI8226 與 MG －63 細胞用10%FCS－DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，2～4天換液傳代。盼藍拒染試驗檢測活細胞率均在95%以上。

4．條件培養(yǎng)液收集:當RPMI8226和MG－63細胞株處于對數生長期時，以1×105/ml密度傳代接至25cm2細胞培養(yǎng)瓶內，培養(yǎng)2天后將細胞懸液或上清液移至離心管中，離心力200g，離心5min后，取上清液，離心力500～600g，離心10min完全去除細胞后，收集條件培養(yǎng)液，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

5．TRAP染色:根據試劑盒使用說明書的步驟進行。RAW264．7細胞以1．5×104/孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后更換不同條件培養(yǎng)液(100ng/ml rhRANKL、30%MG－63細胞條件培養(yǎng)液、30%RPMI8226細胞條件培養(yǎng)液以及 1μg/ml RANKLmAb干預組)，第7天TRAP染色，細胞用4%多聚甲醛固定10min后，加染色液，37℃避光水浴90min后，雙蒸水洗3次，干燥后用中性樹脂封固，光鏡下計數(放大100倍)各組每孔中TRAP陽性多核破骨細胞(≥3個核)的數量，并攝片記錄。

6．RT－PCR 檢測:每106～107RPMI8226、MG －63細胞或每孔加入1．0ml Trizol混勻，以一步法抽提總RNA，紫外分光光度法檢測RNA濃度和純度，各組OD260/OD280比值(＞1.8)。反轉錄體系含 RNA 1μg，dNTP 2．0μl，M －Mulv 反轉錄酶 1μl，引物 1μl，以 DEPC 水補充至 20μl，42℃，60min，70℃，10min完成反轉錄反應。RT－PCR反應體系為15μl。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，掃描條帶后用Quantity One軟件分析測定各擴增帶A值(吸光度)。用目的條帶吸光度與內參(β－actin)條帶吸光度之比表示組織目的基因mRNA的含量，重復實驗3次。各反應條件如表1。

7．Western blotting法檢測:RPMI8226和MG－63細胞取對數生長期時傳代，以1×105/ml密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)3天后分別通過離心或細胞刮刀獲取細胞，提取總蛋白。將20μl蛋白經12%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠(SDS－PAGE)電泳分離后，轉移至PVDF膜，于搖床上封閉1．5h，分別加入鼠抗人RANKL單克隆抗體(MAB6261)和兔抗人β－actin單克隆抗體，4℃過夜，TBST充分漂洗。加入辣根過氧化物酶連接的羊抗鼠IgG室溫輕搖1．5h，同上漂洗，與ECL化學發(fā)光試劑反應，常規(guī)方法顯色、定影。

結 果

1．RANKL和mRANKL裂解酶(TACE、ADAM19)mRNA表達:本試驗以能表達RANKL的MG－63細胞為陽性對照［10］，發(fā)現 RPMI8226細胞能表達RANKL mRNA(255bp)和兩種RANKL裂解酶:TACE mRNA(440bp)和 ADAM19 mRNA(625bp)，而MMP14兩種細胞均未檢測到(圖1、圖2)。

2．Western blotting法檢測RANKL表達:本試驗證實 RPMI8226細胞表達 mRANKL(跨膜型)和sRANKL(可溶型)蛋白(圖3)。

圖3 Western blotting法檢測RPMI8226細胞表達RANKL蛋白

3．TRAP染色觀察 RAW264．7細胞形態(tài):TRAP染色觀察不同實驗組中RAW264．7細胞培養(yǎng)7天的變化。無誘導的RAW264．7細胞胞體較小，橢圓形，或梭形，大部分細胞呈TRAP陰性單核細胞，少數為TRAP陽性的單核或多核細胞。加條件培養(yǎng)液或重組RANKL蛋白的RAW264．7細胞中出現成熟破骨細胞明顯增多，胞體較大，形態(tài)不規(guī)則，呈油煎蛋形或漏斗形等，幾個到幾十個不等的細胞核(≥3個)，核圓形，大小較一致，互相擁擠或重疊，細胞邊緣見偽足樣突起，胞質呈空泡狀，胞質TRAP酶活性部位呈玫瑰紅色，細胞核為陰性，即為TRAP陽性多核成熟破骨細胞(圖4)。

圖4 RAW264．7細胞株TRAP染色形態(tài)圖A．空白組(×100);B．100ng/ml rhRANKL組(×100);C．30%RPMI8226條件培養(yǎng)液組(×100);D．30%MG－63條件培養(yǎng)液組(×100)

4．TRAP陽性的多核破骨細胞計數:(1)100ng/ml rhRANKL、30%RPMI8226細胞與30%MG－63細胞條件培養(yǎng)液對RAW264．7細胞的誘導分化作用:此3組培養(yǎng)液誘導的TRAP陽性多核破骨細胞數和空白組比較有顯著差別(p＜0．01)。100ng/ml rhRANKL誘導分化作用比其他兩誘導組明顯(p＜0.01)(表 2)。(2)1μg/ml RANKL mAb抑制 RPMI8226細胞條件培養(yǎng)液與rhRANKL的誘導分化作用:1μg/ml RANKL mAb抑制30%RPMI8226條件培養(yǎng)液或100ng/ml rhRANKL誘導的TRAP陽性多核破骨細胞數明顯低于不加抗體的誘導組，p＜0．01。1μg/ml RANKL mAb阻斷30%RPMI8226條件培養(yǎng)液組與空白組無差別;而1μg/ml RANKL mAb阻斷100ng/mL rhRANKL組相比空白組有統(tǒng)計學意義，p＜0．05(表 3)。

表2 rhRANKL、RPMI8226與MG－63細胞條件培養(yǎng)液誘導RAW264．7細胞分化為TRAP陽性多核破骨細胞

表3 1μg/ml RANKL mAb抑制RPMI8226細胞株條件培養(yǎng)液與rhRANKL的誘導分化作用

5．破骨細胞表型基因TRAPmRNA表達:加30%MG－63細胞條件培養(yǎng)液、30%RPMI8226細胞條件培養(yǎng)液或 100ng/ml rhRANKL的 RAW264．7細胞TRAP基因表達量明顯高于空白組，p＜0．01。30%RPMI8226細胞條件培養(yǎng)液組比30%RPMI8226細胞株條件培養(yǎng)液+1μg/ml RANKL mAb組TRAP表達量高，P ＜0．05(表4與圖5)。

表4 各試驗組TRAP mRNA表達

圖5 各試驗組誘導RAW264．7細胞株表型基因TRAP的表達

討 論

RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)在MBD的破骨細胞分化和功能調節(jié)中起舉足輕重的作用。但目前國內外對骨髓瘤細胞本身是否表達RANKL仍未存在爭議。

Sezer等［2］利用流式細胞術，免疫細胞化學染色和免疫印跡法發(fā)現6種人MM細胞株如RPMI8226，U266等和6例MBD患者的MM細胞都表達RANKL。Heider等［3］以流式細胞儀分析正常漿細胞發(fā)現胞膜上RANKL不表達或弱表達，但伴骨質破壞患者的MM細胞胞膜RANKL表達顯著高于正常人和無骨質破壞患者，差異有統(tǒng)計學意義。Croucher等［4］用 RT－PCR和流式細胞術證明了純化的5T2MM鼠骨髓瘤細胞中RANKL mRNA和蛋白的表達。Farrugia等［5］用流式細胞術和RT－PCR法分析高度純化的人MM細胞表達RANKL蛋白和mRNA。

然而仍有許多專家持反對意見，認為MM細胞不自主分泌RANKL，而是誘導骨髓微環(huán)境中其他細胞分泌RANKL，促進破骨細胞與MM細胞的生長、存活和分化。Giuliani等［6］利用免疫印跡法和RT－PCR發(fā)現10種人MM細胞株如U266等，和26例MM患者的MM細胞均不表達 RANKL，僅產生極少量的OPG。在細胞共同培養(yǎng)中，人MM細胞促進人骨髓前成骨細胞或基質細胞上調RANKL mRNA和蛋白的表達，明顯下調OPG生成，這一作用依賴于細胞間的直接接觸。同樣，Pearse等［7］檢測5種骨髓瘤細胞株也未發(fā)現RANKL蛋白和mRNA的表達。

基于上述研究，本試驗著眼于MM細胞自身是否表達RANKL以及其功能展開深入研究。MBD研究迄今為止，已有多種分離MM細胞的方法，但常混雜其他細胞，所以選取經典的人MM細胞株RPMI8226作為研究對象。我們采用免疫印跡法證明了RPMI8226細胞能表達 mRANKL蛋白(46/48kDa)和sRANKL 蛋白(24/26kDa)，這與 Sezer等［2］的研究結果相同。而且 RPMI8226細胞表達的 mRANKL和sRANKL分子質量大小與Lacey等［8］的研究結果相一致。RANKL在體內有mRANKL和sRANKL兩種形式，sRANKL分為原發(fā)分泌型和蛋白酶裂解膜蛋白型。目前已知的RANKL裂解酶主要有3種:腫瘤壞死因子α轉化酶(TACE)，解聚素－基質金屬蛋白酶19(ADAM19)和Ⅰ型膜型基質金屬蛋白酶(MMP14)［9，10］。本試驗結果發(fā)現 RPMI8226 細胞表達2種RANKL裂解酶TACE和ADAM19 mRNA。證明了RPMI8226細胞通過自主分泌或RANKL裂解酶TACE、ADAM19酶解作用產生sRANKL。研究表明不論mRANKL，還是sRANKL均有共同的羧基末端活性受體結合域，因此都能與相同的受體結合，發(fā)揮誘導破骨細胞分化成熟的生物學作用，并且可與 OPG結合，失去生物學活性。

本研究發(fā)現RPMI8226細胞、MG－63細胞條件培養(yǎng)液與rhRANKL(編碼mRANKL胞外段136－317位氨基酸，與 sRANKL序列相似)均能明顯誘導RAW264．7細胞分化為TRAP陽性的多核破骨細胞。說明RPMI8226細胞條件培養(yǎng)液中存在能誘導RAW264．7細胞分化成熟的物質。這與Lai等報道的人骨髓瘤細胞株NCI－H929，U266的條件培養(yǎng)液能誘導人骨髓單個核細胞分化為TRAP陽性的多核破骨細胞一致。同時1μg/ml人抑制性RANKL單克隆抗體能顯著阻斷30%RPMI8226細胞條件培養(yǎng)液與100ng/ml rhRANKL誘導的RAW264．7細胞株分化成熟作用，間接證明了RPMI8226細胞條件培養(yǎng)液中起誘導作用的重要成分為sRANKL。

同時本試驗通過RT－PCR顯示rhRANKL、MG－63細胞與 RPMI8226細胞條件培養(yǎng)液能誘導RAW264．7 細胞上調 TRAP mRNA。1μg/ml人抑制性RANKL單克隆抗體能抑制30%RPMI8226細胞條件培養(yǎng)液的誘導分化作用使TRAP mRNA表達與空白組相近，并與TRAP染色實驗的結果一致。1μg/ml人抑制性 RANKL單克隆抗體阻斷100ng/ml rhRANKL誘導的TRAP mRNA表達高于空白組，和TRAP染色實驗的結果一致，這可能與100ng/ml rhRANKL未被單克隆抗體完全中和有關。

目前我們證實了骨髓瘤RPMI8226細胞能表達RANKL，且其細胞培養(yǎng)液所含 sRANKL具有促使RAW264．7細胞分化為成熟破骨細胞的生物活性。這一發(fā)現將為探索骨髓瘤骨病的分子機制以及尋找治療新靶點，提供實驗和理論基礎。

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