脂肪間質干細胞對肝星狀細胞活化、增殖、凋亡相關作用的研究

俞富祥 季世強 蘇龍豐 張啟瑜

近年來，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化與增殖是肝纖維化發生發展的中心環節，已逐漸獲得共識。有較多研究顯示，骨髓間質干細胞可抑制HSCs活化和肝纖維化進展［1，2］。但骨髓源性間充質干細胞來源困難、取材不易，使其應用前景受限。而脂肪間質干細胞(adipose tissue－derived mesenchymal stem cells，ADSCs)與骨髓間質干細胞相比較而言，不僅來源豐富，取材容易，而且具有自我更新、多向分化和高增殖特性等重要干細胞特征，與骨髓間質干細胞相類似［3，4］。本研究主要探討 ADSCs在細胞水平對大鼠肝纖維化的影響。

材料與方法

1．材料及試劑:健康6周齡 SD大鼠10只，體重150～200g，供分離ADSCs及HSCs，由溫州醫學院實驗動物中心提供;L－DMEM培養基，購自Hyclone公司;小牛血清購自Gibco公司;Ⅳ型膠原酶、DNaseⅠ購自Sigma公司;Optiprep分離液購自AXISSHIELD 公司;孔徑 0．4μm Transwell insert半透膜及6孔塑料培養板購自Millipore公司;鼠抗平滑肌肌動蛋白(α－SMA)單克隆抗體、標記FITC的山羊抗鼠抗體購自Southern－Biotech公司;Hoechst33342購自 Sigma公司，AEC試劑盒購自博士德生物公司。

2．細胞分離及培養:(1)脂肪間質干細胞(adipose tissuederived mesenchymal stem cells，ADSCs)的分離、培養:在無菌條件下，從健康SD大鼠腹腔內獲取脂肪組織1～2mg，充分剪碎后加入分離液2ml(含1mg/ml膠原酶)消化，37℃振蕩搖晃1h，然后以200×g離心5min，沉積的細胞用含10%FBS的DMEM培養液制成均勻的細胞懸液，均勻接種于培養皿中，37℃、5%CO2孵箱中培養，培養至皿底80%時傳代，每2～3天換液1次。采用第3～5代ADSCs，用免疫熒光染色方法檢測ADSCs相對特異細胞表面標志CD73、CD90及CD45。(2)大鼠正常肝細胞系(buffalo rat liver cells，BRLs)的培養:BRLs由溫州醫學院龍灣實驗中心贈與，復蘇后接種于培養瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中常規培養。培養液為含10%小牛血清的L－DMEM，每2～3天換液1次。(3)HSCs分離與培養:按實驗室前期建立的方法進行分離HSCs。用含10%小牛血清的L－DMEM培養基接種于塑料培養瓶。常規培養48h后換液，5～7天后HSCs活化，增殖迅速。根據細胞生長情況每2～3天換液1次。

3．細胞共培養方法的建立:根據孔徑0．4μm的transwell insert半透膜僅可以通過培養液而不能透過細胞的特點，在6孔塑料培養板上架起transwell insert半透膜，建立雙層細胞共用培養液而不直接接觸的培養體系。每孔培養體系上層接種ADSCs 2×104cells/well，培養體系下層接種原代及第3代的HSCs 2×104cells/well。另設 BRLs代替 ADSCs作為陰性對照，單純培養的 HSCs為空白對照。各組均采用37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱常規培養，培養液為含10%小牛血清L－DMEM。培養72h后，倒置相差顯微鏡下動態觀察活體細胞形態學改變。

4．ADSCs對HSCs活化的影響:本實驗通過Western blotting法檢測HSCsα－肌動蛋白(α－SMA)的表達，確定HSCs的活化狀態。按前述方法在共培養72h后，在各培養體系HSCs中分別加入現配的細胞裂解液，冰上裂解30min，于4℃12000r/min離心15min，取上清進行蛋白定量。取一定量蛋白樣品上樣。SDS－PAGE膠電泳分離，轉移至PVDF膜，封閉緩沖液室溫搖床振蕩1h，加入一抗體 α －SMA(1∶100)，4℃過夜，TBST 漂洗 3 次，10 分鐘/次，孵育二抗(1∶30000)，37℃ 恒溫振搖1h;TBST漂洗3次，10分鐘/次，化學發光，顯影、定影，對膠片圖像掃描，用凝膠圖像處理系統Gel－Pro analyzer分析目標帶的灰值。

5．CCK－8比色法檢測ADSCs對HSCs增殖的影響:按前述方法在共培養72h后，每孔加入CCK－8溶液80μl，繼續培養2h，用自動酶標儀于450nm處檢測每孔的吸光度(A)值，間接計算細胞增殖程度。

6．流式細胞儀檢測ADSCs對HSCs凋亡的影響:按前述方法在共培養72h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，每個樣本收集約2×105個細胞，1500r/min離心5min后，棄去培養液，用PBS洗滌細胞2次，1500r/min離心5min，加入200μl Binding Buffer重懸細胞;加入5μl Annexin V－FITC混勻后，再加入5μl Propidium Iodide，混勻;室溫、避光反應20min后上機檢測，流式細胞儀激發波長488nm，發射波長530nm。

7．細胞培養液細胞因子的測定:為探究ADSCs如何能促使HSCs發生細胞凋亡，并抑制HSCs活化，從而發揮抗肝纖維化的作用，我們推測ADSCs可能通過分泌細胞因子，從而間接影響HSCs。我們將ADSCs及BRLs分別單獨培養于6孔塑料培養板，每孔培養細胞2×105個，培養72h后，分別取培養液，使用各種細胞因子(如肝細胞生長因子HGF、轉化生長因子TGF、及神經生長因子NGF等)ELISA試劑盒，按照試劑盒指示說明，檢測其中的細胞因子含量。

結 果

1．HSCs的分離、培養和形態學特點:每只大鼠HSCs的獲得率約為(1～2)×107，臺盼藍染色細胞存活力＞95%。相差顯微鏡下，剛分離出來的HSCs呈圓球形，胞質內含較多脂肪小滴，熒光顯微鏡在328nm波長的激發光下，可觀察到藍綠色熒光。培養2～3天后，細胞貼壁;5～7天后，細胞伸展呈星形。見圖1。

圖1 鼠原代HSCs

2．ADSCs的分離、培養和形態學特點:取大鼠腹股溝處脂肪組織1～2mg，可以分離消化出(1～2)×106個ADSCs。經臺盼藍染色可確定細胞的存活率95%以上。培養4～6h后即可見部分細胞貼壁，呈短棒形。48h后可見細胞呈梭形生長。5～6天后細胞生長迅速，當細胞生長至80%匯合時，即可傳代培養(圖2)。

3．ADSCs抑制 HSCsα －SMA的表達:共培養72h，免疫細胞化學染色測定α－SMA在HSCs中表達情況，可見陽性染色的α－SMA位于胞質內，呈高張力纖維狀分布，ADSCs+HSCs組HSCs胞質內α－SMA表達較BRLs+HSCs組明顯降低，結果見圖3。通過Western blotting法檢測α－的表達，與BRLs+HSCs組比較，發現 ADSCs+HSCs組 HSCsα－SMA表達水平明顯下降，結果見圖4。

4．ADSCs抑制 HSCs的增殖:本實驗以單獨HSCs培養的細胞數作為參照值，利用吸光度值間接推算細胞增殖程度。與BRLs對照組相比，HSCs與ADSCs共培養72h，HSCs增殖活性受抑制明顯(p＜0．05)，見圖5。光學顯微鏡下，HSCs的細胞形態無顯著變化，培養體系中相應的ADSCs及BRLs的生長狀態良好。

圖5 各培養體系中HSCs的細胞增殖程度比較

5．HSCs的凋亡情況:HSCs凋亡率流式細胞儀檢測結果顯示，ADSCs+HSCs組的HSCs凋亡率最高，與BRLs+HSCs組、單獨HSCs組相比差異有顯著性意義(P ＜0．05)，見圖6、圖7。

圖6 HSCs的凋亡情況

圖7 各培養體系中HSCs的細胞凋亡程度比較

6．細胞培養液中細胞因子濃度的測定(pg/ml):通過測定細胞培養液中細胞因子含量發現ADSCs分泌的細胞因子中，與肝細胞比較，HGF量較多(p＜0.05)，而TGF分泌量明顯較少(p＜0．01)，而 NGF兩者之間無顯著差別(P＞0．05)，見表1。

表1 兩種細胞培養液中各細胞因子含量比較

討 論

HSCs屬于肝臟的間質細胞，它在肝纖維化過程中扮演著重要的角色，現已成共識［1，2，5～7］。在病理條件下如肝臟受到物理、化學及病毒感染生物因素的刺激時，HSCs增殖并激活，激活的HSCs通過增生和分泌細胞外基質，對肝纖維化的形成起著至關重要作用。

國內外已有研究顯示，骨髓間質干細胞通過抑制HSCs的活化而達到緩解肝纖維化進展［5～7］。但骨髓干細胞獲取創傷大，且數量少，影響其在臨床及研究領域的進一步廣泛應用。自Zuk PA等于2001年首次報道從人脂肪組織中分離出ADSCs以來，已有較多研究先后證實了這些細胞在合適誘導劑的作用下可向成骨、軟骨、脂肪和成肌等細胞分化，表現出與骨髓間質干細胞相類似的高增殖活性與多向分化潛能等干細胞特性［3，4，8］。而 ADSCs與骨髓干細胞比較而言，因其數量多、獲取方便等優勢，成為干細胞移植治療慢性肝病又一頗具發展前景的待選細胞，為當前組織工程種子細胞研究的重點。

既往干細胞移植治療肝硬化，多集中于研究探討干細胞在肝內生長分化為肝細胞，從而達到改善肝功能的作用。有實驗顯示，HSCs的活化與增殖是肝纖維化發生發展的中心環節［9］。那么ADSCs是否可通過調控HSCs的增殖與活化發揮對肝纖維化的抑制作用?為探討ADSCs是否能夠抑制HSCs活化與增殖，我們利用孔徑0．4μm的transwell僅透過培養液而不能通過細胞的特點，建立ADSCs與HSCs非直接接觸的共培養體系，初步的結果顯示HSCs的活化、增殖較BRLs等共培養體系明顯抑制，表明ADSCs可以通過非直接接觸抑制HSCs活化與增殖。

越來越多的研究顯示，通過誘導活化態HSCs凋亡，進而減少細胞外基質分泌，是治愈肝纖維化的關鍵［10］。動物肝纖維化模型自發逆轉的研究顯示，誘導活化態HSCs的凋亡是肝纖維化得以逆轉的關鍵［11，12］。我們通過此共培養體系，發現 ADSCs不僅能抑制HSCs活化與增殖，而且還可以促進HSCs凋亡，最終使活化態 HSCs數量減少，從而有效減弱HSCs在肝纖維化過程中的作用。

對于干細胞如何起到抗肝纖維化作用，其機制至今尚未明確。有文獻認為是多因素作用，主要包括兩方面:一是通過干細胞分化為功能性肝細胞，促進肝再生;二是干細胞通過直接抑制其增殖激活并誘導HSCs凋亡，同時分泌抗纖維化物質如HGF、NGF等。有文獻報道，HGF及NGF均有促進HSCs凋亡的作用，同時具有誘使ADSCs向肝細胞分化的功能，還抑制TGF－β1的產生，阻止肝臟發生纖維化，并具有抗肝細胞凋亡的活性。我們通過測定細胞培養液中細胞因子含量也發現ADSCs與對照組肝細胞比較，可分泌較多量HGF、較少量分泌TGF(p＜0.05)。因此，根據本研究結果，我們推測ADSCs可能通過分泌多種細胞因子聯合抑制HSCs的增殖與活化，促使HSCs凋亡，從而在治療肝纖維化中發揮作用。

總之，根據目前初步研究成果顯示，ADSCs可抑制HSCs活化、增殖，促進凋亡。但對ADSCs研究起步時間相對較晚，因而研究深度不及其他類型的間質干細胞，諸如ADSCs活體移植問題，干細胞移植的致瘤性問題及異體ADSCs的移植排斥等問題均有待進一步深入研究。

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