舒肝顆粒對大鼠肝星狀細胞的凋亡的影響

秦文燕 曹群奮 李昌平

肝纖維化是大多數慢性肝病所共有的病理特征，也是慢性肝炎進一步向肝硬化和肝癌發展的重要環節［1］。而肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化增殖是肝纖維化形成的主要細胞基礎，細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)的大量合成是肝纖維化形成的直接原因，也是肝纖維化發生的中心環節［2］?；罨腍SC主要通過凋亡機制減少，故促進HSC凋亡可逆轉肝纖維化［3］。鑒于HSC在肝纖維化發病機制中的主導作用，大多數抗肝纖維化研究都以HSC為靶標。所以，抑制HSC的活化和增殖，促進HSC的凋亡，成為治療肝纖維化的基本策略。已有實驗證明舒肝顆?？赏ㄟ^抑制HSC增殖和膠原蛋白的分泌，減少膠原纖維在肝臟內的沉積，但它是否具有促進肝星狀細胞凋亡，及其可能的作用機制，未曾進行過研究，故本實驗選擇觀察舒肝顆粒作用于體外培養的活化的大鼠肝星狀細胞，采用流式細胞儀進行檢測結果［4］。

肝星狀細胞凋亡機制較為復雜，可通過多途徑凋亡。目前，國內外對中藥誘導HSC凋亡的研究實驗已逐漸展開，而中藥具有多層次、多靶點的抗纖維化作用，且不良反應少，價格低廉，擁有廣闊的前景，值得我們深入研究和實踐。HSC凋亡途徑主要包括:①經典的線粒體途徑;② 死亡受體途徑:包括Fas/FasL途徑、腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)途徑和腫瘤壞死因子－α(TNF－α)途徑;③非死亡受體途徑。本實驗選擇死亡受體途徑及Bcl家族蛋白兩條途徑，對舒肝顆?？赡苷T導肝星狀細胞凋亡的機制進行探討。

材料與方法

1．實驗材料:肝星狀細胞株HSC－T6，購自上海中醫藥大學肝病研究所，其表型為活化的HSC。舒肝顆粒由瀘州醫學院附屬醫院藥物研究所提供、特級胎牛血清、RPMI 1640培養基、胰蛋白酶購自北京元亨圣馬生物技術研究所，Annexin－v/FITC抗體購自Beckman公司，CD95抗體、Bax抗體、Bcl－2抗體購自Sant Cruz Biotechnoloyg公司，濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2．實驗方法:(1)舒肝顆粒的配制:參照楊玲等［5］方法，由于直接加藥法和含藥血清法所得結果一致。取舒肝顆粒10g，用178ml蒸餾水溶解，裝入250ml玻璃瓶中，高壓蒸氣滅菌，用0．45μm的濾器除菌及雜質，取100ml濾液，其濃度56mg/ml，再用0．22μm的濾器過濾除菌分裝。(2)實驗分組:實驗組:肝星狀細胞10%特級胎牛血清RPMI 1640培養液中加入舒肝顆粒藥液，參照李志等［4］研究結果，根據預實驗情況，設置3個藥物濃度組，分別:4.2mg/ml舒肝顆粒組;2.8mg/ml舒肝顆粒組;1．4mg/ml舒肝顆粒組。對照組:肝星狀細胞10%特級胎牛血清RPMI 1640培養液中不加其他處理因素。(3)HSC－T6的復蘇與培養:從液氮罐中取出細胞凍存管，迅速置入37℃水浴中，輕輕振蕩至凍存液完全溶解(1～2min)。75%乙醇擦拭凍存管后打開，將凍存液吸入15ml無菌離心管中，邊滴加含10%PBS的DMEM培養基邊振蕩混勻。1000r/min離心5min，吸棄上清液，重復洗1次，再加入含10%PBS的RPMI 1640培養基3ml，接種于25ml培養瓶中，放入37℃、5%CO2培養箱中培養，24h后，更換培養基繼續培養。待細胞將近長滿培養瓶底時，用0．25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代。(4)流式細胞儀檢測舒肝顆粒對肝星狀細胞凋亡的影響:細胞復蘇后，胰酶消化、離心、吹打、計數、調整細胞濃度5×104左右，接種六孔板，培養1天，分組加藥，繼續培養24h，鏡下觀測細胞形態的變化。然后分別按實驗組和對照組進行流式細胞儀檢測，每組選4個復孔，行5次檢測。具體如下:吹打細胞，使其成為單細胞懸液，收集細胞液，1500r/min離心，冷PBS沖洗，再離心，丟棄上清液，每根試管中加入100μl冷PBS，振蕩器振蕩搖勻成單細胞懸液，調整細胞濃度1×106/ml，緩沖液稀釋1∶4(4ml結合緩沖液加16ml去離子水)，取100μl細胞懸液，于5ml流式管中加入5μl Annexin V/FITC和10μl 20mg/ml碘化丙錠 (propidine iodide，PI)，混勻后室溫避光孵育15min，在反應管中加入400μl PBS上機分析。(5)流式細胞儀檢測舒肝顆粒對CD95的影響:方法如上述，細胞復蘇后，接種六孔板，培養一天，按實驗組和對照組分別加藥，繼續培養24h后，鏡下觀測細胞形態的變化。同樣用流式細胞儀檢測CD95表達。(6)免疫細胞化學法檢測Bax、Bcl－2的表達:取對數生長期細胞經上述相同處理后接種于置有經多聚賴氨酸處理的蓋玻片的24孔板中，置于37℃，5%CO2孵箱中培養，待細胞生長達70%融合，將細胞分4組:空白對照組、4.2mg/ml舒肝顆粒組;2．8mg/ml舒肝顆粒組;1.4mg/ml舒肝顆粒組。以無血清培養基洗細胞3次，加入不同濃度舒肝顆粒。舒肝顆粒處理24h后，采用4%多聚甲醛固定細胞15min，0．3%Tri－tonX －100通透細胞 30min，3%過氧化氫－甲醇液中浸泡10min，非免疫性動物血清中孵10min，加一抗(Bax抗體)4℃冰箱過夜后，生物素標記的二抗中孵育10min，加HRP標記鏈親和素孵育10min(以上每次操作均用PBS洗細胞3次后再進行下一步)。然后進行DAB顯色(顯微鏡下觀察掌握顯色程度):自來水充分沖洗，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，照相。以PBS代替一抗作陰性對照實驗。同樣的方法檢測Bcl－2表達。Bax、Bcl－2陽性結果判斷:陽性信號為棕黃色或棕褐色，位于細胞質的線粒體膜、內質網膜及核膜上，用Imge plus 7．0版專業圖像處理軟件半定量分析系統對各組肝星狀細胞Bax和Bcl－2反應細胞進行顯微圖像分析，每組隨機檢測4個視野細胞的光密度，計算其積分光密度，并計算出Bax/Bcl－2的比值。

結 果

1．舒肝顆粒對肝星狀細胞凋亡的影響:從FITC和PI熒光雙參數點圖觀察到，對照組HSC－T6細胞主要分布在3區，因操作等原因引起的機械性死亡細胞數量非常少(＜2%)。正常對照組(n=20)的凋亡率是3.40% ±0．82%，不同濃度的舒肝顆粒1.4mg/ml(n=20)、2.8mg/ml(n=20)、4.2mg/ml(n=20)組，對應的肝星狀細胞的凋亡率分別是:42.61%±6.42%、61.07% ±3.19%、87.84% ±5.49%。在1.4mg/ml組，肝星狀細胞的早期凋亡率明顯較正常對照組增加，而中晚期凋亡率較少。在2．8mg/ml組，肝星狀細胞的早期凋亡率和中晚期凋亡率均明顯升高。4．2mg/ml組，肝星狀細胞在舒肝顆粒作用24h后，大部分已屬于中晚期凋亡，早期凋亡較低濃度組明顯減少，但較正常對照組仍明顯增高，從早期凋亡和中晚期凋亡的總體趨勢看，隨著濃度增高，總的凋亡率增加，且各組間的差別具有統計學意義(F=2847．115，P ＜0．01)，具體見圖 1。

圖1 流式細胞術檢測舒肝顆粒對HSC凋亡的作用

2．舒肝顆粒對肝星狀細胞表達CD95的影響:活化的大鼠肝星狀細胞經不同濃度的舒肝顆粒作用24h后，經流式細胞儀檢測熒光標記的CD95的表達率。正常對照組(n=20)的 CD95的表達率是0.10% ±0．04%，不同濃度的舒肝顆粒1．4mg/ml(n=20)、2．8mg/ml(n=20)、4．2mg/ml(n=20)組，CD95 的表達分別是:4.77%±0.84%、9.44%±0.61%、24.51%±5．91%，并隨著濃度增高，CD95的表達率也增高，且各組間的差別具體統計學意義(F=810．155，p＜0.05)。

3．舒肝顆粒對肝星狀細胞表達凋亡蛋白Bax/Bcl－2的影響:Bax的表達正常組為 574．17±190．97，隨著藥物濃度組的增高，Bax的表達增多，不同濃度的舒肝顆粒 1．4、2．8、4．2mg/ml，對 Bax 的表達分別是:1113．14 ± 556．74、1418．75 ± 604．05、1765．43 ±716．801，且各組間差別具有統計學意義(F=3．729，p＜0．05)，Bcl－2的表達，藥物濃度組與正常對照組無明顯差別，(F=2．70，P ＞0．05)。但總體 Bax/Bcl－2的比值隨著藥物濃度組的增加而升高，具體見表1及圖2。

表1 不同濃度的舒肝顆粒作用HSC后Bax和Bcl－2的IOD值及Bax/Bcl－2比值

圖2 Bax表達(SABC，×400)

討 論

HSC是一種主要合成分泌細胞外基質(ECM)和膠原酶的間質細胞。激活的HSC的減少主要不是通過轉化為靜止的HSC實現，而是凋亡的結果。HSC凋亡是導致HSC數量減少的中心環節。促進HSC凋亡有利于肝纖維化的逆轉并可能成為未來抗肝纖維化的突破口。現研究表明HSC凋亡是轉化依賴性的，即轉化中與激活后的HSC才能發生凋亡并且與激活程度相平行［6］。本實驗所采用的是激活后的HSC，這符合肝纖維化中HSC的狀態。本實驗結果表明，舒肝顆粒在1．4～4．2mg/ml濃度范圍內，舒肝顆粒無細胞毒性作用，能誘導HSC凋亡，其作用呈劑量依賴性。1．4mg/ml舒肝顆粒作用HSC－T6 24h，流式細胞儀檢測Annexin V單陽性細胞即凋亡細胞開始增多，至4．2mg/ml時 Annexinv及PI雙陽性細胞即壞死細胞也開始增多。各實驗組總的凋亡率，隨舒肝顆粒濃度的增高，而增高，各組間的差別具有統計學意義。這表明舒肝顆粒科誘導肝星狀細胞凋亡，且具體濃度依賴性。

肝星狀細胞可通過多途徑凋亡。激活的HSC凋亡主要通過死亡因子FasL及其相應的死亡因子受體(Fas也稱Apo－21或CD95)介導的信號傳導途徑，它是機體內細胞凋亡的主要途徑之一。研究發現，因為隨著HSC活化的進展，其表達Fas和FasL不斷地增加，用阻斷Fas的抗體可以完全阻止正常的和已經進入凋亡周期的星狀細胞繼續凋亡;用其激活抗體則可以顯著增加凋亡細胞數量［7］。為了進一步探討舒肝顆粒誘導HSC凋亡的可能作用機制，本實驗通過流式細胞儀檢測舒肝顆粒作用24h的HSC細胞，是否有死亡因子受體CD95的表達增多。實驗結果表明隨著舒肝顆粒濃度的增高，其CD95的表達明顯增強，各組間差別具體統計學意義，提示舒肝顆?？赡苁峭ㄟ^Fas介導的信號傳導途徑誘導HSC凋亡。

HSC的另一條凋亡途徑Bcl－2/Bax家族，Bcl－2類為凋亡抑制因子，Bax類，為凋亡促進因子［8］。正常時Bax類和Bcl－2類這對正負凋亡調節基因在體內形成二聚體，處于動態平衡之中。當Bax的量高于Bcl－2時，誘導細胞凋亡，反之，細胞存活。本實驗研究中發現隨著舒肝顆粒的濃度增高Bax的表達明顯增加，而Bcl－2的表達在正常對照組較少，隨著舒肝顆粒的濃度組增高，Bcl－2的變化無統計學意義，而Bax/Bcl－2的比值明顯增高，促進了HSC的凋亡，考慮Bcl－2沒有明顯的減少，可能是舒肝顆粒誘導肝星狀細胞凋亡的機制中對Bcl－2的表達無明顯影響。Elsharkawy等［3］研究也發現在肝纖維化逆轉中HSCs的凋亡是通過上調caspase－3、Bax實現的。故經舒肝顆粒作用的HSC促凋亡蛋白表達占優勢，對凋亡的敏感性增加而向凋亡轉化，這也可能是舒肝顆粒促進HSC凋亡的作用機制之一。

綜上所述，本實驗可以明確舒肝顆粒可以誘導肝星狀細胞凋亡，且呈濃度依賴，其作用途徑可能為Fas介導的信號傳導途及與Bax蛋白表達上調相關。但舒肝顆粒素通過何種途徑影響HSC的Fas、Bax、P53表達，其具體機制尚不清楚，是否還通過其他信號傳導途徑誘導HSC的凋亡、或通過對凋亡調控基因的調節而影響HSC的凋亡，尚有待于進一步的研究。但本實驗為舒肝顆粒治療肝纖維化臨床應用提供了理論依據。

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3 Elsharkawy AM，Oakley F，Mann DA．The role and regulation of hepatic stellate cell apoptosis in reversal of liver fibrosis［J］．Apoptosis，2005，10(5):927 －939

4 李志，漆紅，李昌平．舒肝顆粒對大鼠肝星狀細胞增殖及膠原分泌的影響［J］．世界華人消化雜志，2010，18(2):169 －172

5 楊玲，朱清靜，笪邦紅，等．中藥抗纖軟肝顆粒抑制PDGF誘導的肝星狀細胞MEK－1和c－fos表達［J］．世界華人消化雜志，2004，12:347－350

6 Guicciardi ME，Gores GJ．Apoptosis as a mechanism for liver disease progression［J］．Semin Liver Dis，2010 30(4):402 －410

7 Kordes C，Sawitza I，Hussinger D．Hepatic and pancreatic stellate cells in focus［J］．Biol Chem，2009，390(10):1003 －1012

8 Shin HW，Park SY，Lee KB，et al．Down－regulation of Wnt signaling during apoptosis of human hepatic stellate cells［J］．Hepatogastroenterology，2009，56(89):208 －212