BMP－7在大鼠肝纖維化組織中的動態表達和意義

朱碧紅 陳永平 戴志娟 葉 超 程 瑗 王曉東

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝臟對各種慢性肝損傷的代償反應所形成的一種肝臟瘢痕組織，并導致細胞外基質(extracellular matrix，ECM)、細胞群和細胞因子的復雜改變，是各種慢性肝病(如病毒性、酒精性、藥物性、膽汁郁積性肝病和非酒精性脂肪肝等)發展的共同途徑，也是進一步向肝硬化發展的必經之路［1，2］。骨形態發生蛋白(bone morphogenetic p rotein，BMP)是一類細胞因子，屬于轉化生長因子TGF－β超家族的一員［3］。骨形態發生蛋白7(BMP－7)亦稱成骨蛋白1(osteogenic protein 1，OP－1)，其拮抗組織纖維化作用在腎、心肌、肺等多種組織中已被證實，但至今為止，BPM－7與肝纖維化的關系，國內外鮮見報道［4］。本研究通過建立大鼠肝纖維化模型，動態觀察BMP－7的表達情況，初步探討BMP－7在肝纖維化發生、發展過程中的作用，為進一步研究其作用機制打下基礎。

材料與方法

1．實驗動物與分組:42只健康雄性SD大鼠，清潔級，質量200～250g，由中國醫學科學院上海實驗動物中心提供。按隨機數字表法分為兩組:對照組6只，肝纖維化模型組36只。

2．實驗動物模型制備:實驗前12h禁食。對照組每周前3天每天1次腹腔內注射0．9%氯化鈉溶液0．2ml/100g，連續4周。將二甲基亞硝胺(DMN，購自日本WAKO生物公司)溶解于0．9%氯化鈉溶液使其最終濃度為0．5%，按0．2ml/100g的劑量腹腔內注射，每周前3天每天1次，連續4周建立肝纖維化模型。

3．取材:造模后4 天、1、2、4、6、8 周按隨機數字表隨機取6只大鼠，留取肝組織，一部分在10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制備組織切片;另取部分肝組織立即液氮凍存，以備RT－PCR檢測。

4．肝組織病理學觀察:取肝組織石蠟切片行常規HE染色及Masson染色(染色試劑盒均購自福州邁新公司)，光學顯微鏡下觀察組織損傷情況。

5．RT－PCR測定肝組織BMP－7 mRNA的表達水平:肝組織研磨，Trizol抽提RNA。引物由上海捷瑞生物公司合成，檢索Pubmed上相關大鼠基因核苷酸序列全長，采用軟件primer5．0分析設計引物序列。BMP－7上游引物:5'－CTGAGGAGGGCTGGTTGGTATT －3'，下游引物:5'－ TGGTGGCGTTCATGTAGGAGTT －3'，產物長度474bp;β －actin上游引物:5'－ GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC －3'，下游引物:5'－ CATCTGCTGGAAGGTGGACA －3'，產物長度452bp。RTPCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，嚴格按試劑盒說明書操作，分別反轉錄和PCR擴增。BMP－7基因擴增參數，94℃ 5min;94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，32 個 循 環;72℃5min。β －actin 基因擴增參數，94℃ 5min;94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，22個循環;72℃ 5min。將5μl RT －PCR 產物加1μ1 6×上樣緩沖液在含0．5μg/ml溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統上顯像，并用Gel－Pro 3．1軟件分析RT－PCR產物電泳條帶，與相應的內參基因吸光度比值作為目的基因mRNA的相對含量。

6．ALT、AST、ALB測定:采用全自動生化分析儀測定不同時間點大鼠血清ALT、AST和ALB水平的變化。

7．統計學方法:數據經SPSS 17．0軟件處理，計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析(One－way ANOVA)進行多組均數間的比較，方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進行Dunnett's T3檢驗。p＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1．病理學觀察:對照組大鼠肝組織質地柔軟，表面光滑;肝纖維化模型組大鼠肝臟質地堅韌，表面粗糙，顏色灰暗，有些可見顆粒狀小結節。HE染色及Masson染色后光學顯微鏡下觀察:對照組大鼠肝小葉結構正常，肝細胞索排列規則有序，肝板以中央靜脈為中心呈條索狀向四周放射狀排列，板間有不規則肝竇，僅于匯管區和中央靜脈周圍有少許膠原纖維存在。肝纖維化模型組多數小葉結構破壞或消失，由匯管區和中央靜脈伸出粗大膠原纖維條索分割、包繞肝小葉，肝細胞索排列紊亂，肝細胞濁腫明顯，壞死出血較多。纖維隔內有大量炎性細胞浸潤，見圖1。

2．肝纖維化模型組血清ALT、AST和ALB的變化:造模后4天，ALT、AST 已顯著升高(P ＜0．05)，在4周達最高峰，而后漸漸下降，但每個時間點均顯著高于對照組水平(p＜0．05)。AST值的變化曲線大致上與ALT一致，見表1。與對照組比較，造模后2周，ALB開始下降(p＜0．05)，且在6周達最低谷。

圖1 對照組與肝纖維化模型組大鼠肝組織病理圖(Masson染色 ×100)

表1 各組大鼠血清學檢測結果(x±s)

3．RT－PCR測 BMP－7 mRNA結果:BMP－7 mRNA在對照組大鼠和肝纖維化模型組大鼠肝組織中均有表達。與對照組相比，肝纖維化模型組4天時BMP－7 mRNA表達顯著減少(p＜0．05)。1～2周與對照組差別無顯著性(均P＞0．05)，1周與4天比較差異無顯著性(P＞0．05)，2周與4天比較顯著升高(p＜0．05)。4周較對照組顯著升高，達高峰(p＜0．05)。6周較對照組顯著升高(p＜0．05)，較4周下降(p＜0．05)。8周較6周有顯著下降(p＜0．05)，與對照組無顯著差異(P＞0．05)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠肝組織BMP－7 mRNA水平變化

表2 各組大鼠肝組織BMP－7 mRNA水平變化

IOD為積分光密度。模型組各時間點與對照組比較，A p＜0．05;模型組各時間點與模型組4周比較，B p＜0．05;模型組各時間點與模型組4天比較，C p＜0．05;模型組6周與模型組8周比較，D p＜0．05

6 2．13113 ±0．25775肝纖維化模型組4 天 6 1．72476 ±0．21199AB 1 周 6 1．91393 ±0．29671B 2 周 6 2．43084 ±0．09363BC 4 周 6 4．58104 ±0．37906AC 6 周 6 3．55517 ±0．30825ABC 8 周 6 1．92141 ±0．26457比值對照組組別 鼠數(只)BMP－7/β－actin IOD BD

討 論

圖2 反轉錄－聚合酶鏈反應檢測各組大鼠BMP－7 mRNA的表達

BMP－7是一種分泌型多功能蛋白，分布范圍極其廣泛，主要分布在骨骼、腎、腎上腺、前列腺、膀胱等處，相對分子質量約為35kDa，在細胞內以前體形式合成，前體分子經蛋白水解酶酶解后再通過二硫鍵結合形成成熟的二聚體分子，可以釋放到細胞外與機體各處靶細胞表面特殊的受體結合，介導Smad細胞間信號，激活特殊的基因發揮作用［5］。目前對BMP－7的研究大多集中在腎臟、骨骼系統、眼、心臟、肺等方面。Wang等［6］在腎病研究的實驗中發現，BMP－7具有刺激或誘導基質金屬蛋白酶－2(MMP－2)降解ECM的作用。Schnabl等［7］研究顯示，BMP－7在鼠晶狀體上皮細胞向間充質細胞轉變(EMT)過程中，阻止晶狀體纖維組織的形成。還有研究發現，BMP－7具有能夠減少炎癥因子的釋放、維持細胞內環境穩定的作用［8，9］。

肝纖維化是指肝細胞發生壞死及炎癥刺激時，肝臟中膠原蛋白等ECM的增生與降解失去平衡，進而導致肝臟內纖維結締組織異常沉積的病理過程。炎癥反應也參與肝纖維化過程［12］。本研究通過腹腔內注射DMN建立大鼠肝纖維化模型。實驗中發現，BMP－7 mRNA在對照組大鼠和肝纖維化模型組大鼠肝組織中均有表達。與對照組相比，模型組4天時BMP－7 mRNA表達顯著減少。1～2周與對照組差別無顯著性，1周與4天比較差異無顯著性，2周與4天比較顯著升高。4周較對照組顯著升高，達高峰。6周較對照組顯著升高，較4周下降。8周較6周有顯著下降，與對照組無顯著差異。這與張立英等研究發現的在四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化中，BMP－7的表達隨著時間和纖維化程度的加重而減少相符合，考慮BMP－7可能參與肝纖維化的發生、發展過程，并與肝纖維化的嚴重程度密切相關。研究表明BMP－7可以減少腫瘤壞死因子α刺激產生的多種促炎性因子表達，如IL－6、IL－1、單核細胞趨化蛋白1、1L－8、內皮素2和結締組織生長因子的表達，以起到抗炎癥作用［8］。實驗顯示BMP－7在DMN造模早期出現下降，考慮可能與炎癥早期肝細胞急性損傷時BMP－7大量消耗以減少炎性因子的釋放，減輕炎癥反應造成的實質細胞損傷有關。

肝纖維化是慢性肝臟疾病的共同病理表現，存在復雜的細胞因子網路調控。隨著分子生物學的進展，BMP－7的細胞和分子機制已是世界研究熱點，但到目前為止尚未完全明了。許多研究表明BMP－7通過Smad途徑從基因水平直接拮抗TGF－β的作用。本實驗結果表明，BMP－7參與肝纖維化的發生、發展過程，但BMP－7影響TGF－β/Smad通路的具體作用位點，拮抗肝纖維化的具體機制尚需值得進一步探索，有待于我們更多的研究。

1 Tsukada S，Parsons CJ，Rippe RA．Mechanisms of liver brosis［J］．Clinica Chimica Acta，2006，364(1 －2):33 －60

2 Friedman SL．Molecular mechanisms of hepatic fibrosis and principles of therapy［J］．Gastroenterol，1997，32(3):424 －430

3 Heldin CH，Miyazono K．TGF－βsignaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins［J］．Nature，1997，390(6659):465 －471

4 Weiskirchen R，Meurer SK，Gressner OA，et al．BMP －7 as antagonist of organ fibrosis［J］．Front Biosci，2009，14:4992 － 5012

5 Chen D，Zhao M，Mundy GR．Bone morphogenetic proteins［J］．Growth Factors，2004，22(4):233 －241

6 Wang SE，Wu FY，Shin I，et al．Transforming growth factor β(TGF －β)－Smad target gene protein tyrosine phosphatase receptor type kappa is required for TGF － β function［J］．Mol Cell Bio1，2005，25(11):4703－4715

7 Schnabl B，Kweon YO，Frederick JP，et al．The role of Smad in mediating mouse hepatic stellate cell activation［J］．Hepatology，2001，34:89－110

8 Gould SE，Day M，Jones SS，et al．BMP －7 regulates chemokine，cytokine，and hemodynamic gene expression in proximal tubule cells［J］．Kidney Int，2002，61(1):51 －60

9 Marumo T，Hishikawa K，Yoshikawa M，et al．Epigenetic regulation of BMP7 in the regenerative response to ischemia［J］．J Am Soc Nephrol，2008，19(7):1311 －1320