高血糖對成骨細(xì)胞增殖分化影響的實(shí)驗(yàn)研究

梁軍波 徐春麗 潘偉波 江玲軍 陳海嘯

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis)是糖尿病(diabetes mellitus)患者常見的慢性并發(fā)癥之一，糖尿病骨質(zhì)疏松癥患者存在骨量減少，骨密度降低，骨組織結(jié)構(gòu)受損等病變，因此易導(dǎo)致病理性骨折，致殘率高，給糖尿病患者和社會造成很大的負(fù)擔(dān)，雖然目前對其發(fā)病機(jī)制的研究正不斷深入，但確切發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明［1，2］。

成熟骨組織主要依靠持續(xù)循環(huán)性的破骨和成骨過程，由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞協(xié)同完成。為此我們有理由推測高血糖狀態(tài)下，存在成骨細(xì)胞的增殖分化障礙而致上述循環(huán)被破壞，并最終導(dǎo)致糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)生。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞主要功能活性酶，富含于胞質(zhì)中，它可分解有機(jī)磷酸，增加局部無機(jī)磷酸的濃度，促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化［3］。本實(shí)驗(yàn)擬通過制作糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病大鼠股骨近端的骨密度，以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的病理改變，同時(shí)研究高糖培養(yǎng)條件下成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶的表達(dá)情況，探討高血糖狀態(tài)下成骨細(xì)胞形態(tài)和增殖分化與糖尿病大鼠骨質(zhì)疏松的關(guān)系。

材料與方法

1．模型制作和分組:體重180～200g SD雄性大鼠由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心培育，隨機(jī)分成正常對照組和糖尿病組，其中糖尿病組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后禁食12h，腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(STZ)(美國SIGMA公司)65mg/kg，72h后尾靜脈測血糖，＞16．7mmol/L為造模成功，正常對照組以等量枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射。喂養(yǎng)條件兩組一致。每周測量血糖1次，尿糖1次。

2．骨質(zhì)疏松相關(guān)指標(biāo)及形態(tài)學(xué)觀察:上述大鼠喂養(yǎng)6周后，采用1%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射，充分麻醉后打開腹腔，快速開胸暴露心，經(jīng)4%多聚甲醛固定液灌注后，分離各組大鼠的左側(cè)股骨，于小動物放射成像系統(tǒng)(faxitron modelmx20)上，測其近段骨密度。同時(shí)取右側(cè)股骨內(nèi)髁，置于4%多聚甲醛固定液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。HE染色，在顯微鏡下觀察比較糖尿病模型組和正常大鼠成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的形態(tài)。

3．成骨細(xì)胞培養(yǎng)并檢測:取出生24h內(nèi)的SD大鼠的顱骨，徹底剝離骨膜后置入含DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中修剪成1mm3大小的骨片。加入胰酶振蕩消化(37℃，2～3min)，15%胎牛血清 DMEM終止消化，吹打細(xì)胞，收集消化液，離心10min(4℃，1000r/min)，沉淀細(xì)胞置于含 15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基和PEST(青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml)的培養(yǎng)皿內(nèi)，并以約5×104/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37℃，5%CO2)，每2～3天換液1次。使用第3代細(xì)胞隨機(jī)分為正常培養(yǎng)基組和高糖培養(yǎng)基組(葡萄糖濃度100mmol/L)，分別培養(yǎng)48h后，將貼壁細(xì)胞用40g/L多聚甲醛固定，而后PBS洗滌3次，按比例配制BCIP/NBT染色工作液，48孔板每孔加100μl上述BCIP/NBT染色液，室溫避光孵育5～30min，直至顯色至預(yù)期深淺，去除工作液，用蒸餾水洗滌終止顯色。在100～200倍倒置顯微鏡下，計(jì)數(shù)各組細(xì)胞ALP染色陽性率。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用UTHSCSA Image Tools 3．0(美國德克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院開發(fā))圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)單位面積陽性細(xì)胞數(shù)，數(shù)據(jù)處理采用SPSS 16．0，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，兩組陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．體質(zhì)量和血糖的檢測結(jié)果:成模前兩組大鼠的體重和血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，成模6周后發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠體重明顯減輕，同時(shí)伴血糖升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，表1)。

表1 兩組大鼠成模前后體質(zhì)量、血糖濃度水平的影響

2．骨組織的密度及病理變化:X線顯示糖尿病組大鼠股骨骨皮質(zhì)變薄，骨小梁稀疏，骨密度明顯比正常對照組大鼠下降(圖1)。

圖1 兩組大鼠左側(cè)股骨X線觀察圖

正常組大鼠股骨HE染色結(jié)果表明，軟骨下區(qū)骨小梁未見吸收或斷裂現(xiàn)象，成骨細(xì)胞胞質(zhì)細(xì)密，形狀與骨陷窩一致，軟骨下區(qū)可見新骨形成，破骨細(xì)胞少見。糖尿病大鼠股骨則見骨皮質(zhì)下成骨細(xì)胞顯著減少，成骨細(xì)胞呈扁平或星形，核固縮，形狀與骨陷窩不一致，少見新骨形成。破骨細(xì)胞生長活躍，空骨陷窩明顯增多。骨小梁排列稀疏，結(jié)構(gòu)紊亂(圖2)。

圖2 兩組大鼠股骨HE染色觀察(HE，×400)

3．培養(yǎng)成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及ALP染色結(jié)果:圖3可見正常培養(yǎng)組成骨細(xì)胞可見大部分細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞形狀呈多邊形、梭形、細(xì)胞伸出較多突起，有的突起相互連接，而高糖培養(yǎng)組成骨細(xì)胞不能伸展開，核輪廓不清晰，生長較為分散，堿性磷酸酶染色陽性部位呈紫色細(xì)顆粒狀，各成骨細(xì)胞染色深淺不等，高糖培養(yǎng)組成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈淺藍(lán)色，其(ALP)陽性率為80．9%，顯示其增殖分化能力減弱，而正常培養(yǎng)基組呈深藍(lán)色，其陽性率為94．6%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0．05)。

圖3 兩組成骨細(xì)胞培養(yǎng)ALP染色(ALP，×400)

討 論

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者由于代謝紊亂，普遍伴發(fā)骨質(zhì)疏松癥狀，如X線骨密度儀檢測發(fā)現(xiàn)30．4%糖尿病患者可出現(xiàn)脊柱或髖骨的骨質(zhì)疏松，同時(shí)約14%～20%患者可出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀，其X線檢查可以觀察到骨皮質(zhì)變薄，骨小梁數(shù)量稀疏、紊亂，并隨年齡增加而呈快速上升趨勢［4，5］。本研究顯示大鼠股骨X線片出現(xiàn)骨皮質(zhì)變薄，骨密度降低等癥狀，同時(shí)HE染色顯示骨細(xì)胞呈扁平或星形，胞質(zhì)嗜堿性，細(xì)胞器不發(fā)達(dá)，少見新骨形成。空骨陷窩明顯增多。骨小梁排列稀疏、變細(xì)變薄等明顯的骨質(zhì)疏松病理改變。大量研究表明，糖尿病骨質(zhì)疏松癥除與性別、年齡、糖尿病病程等因素有關(guān)外，糖尿病患者胰島素不足、胰島素生長因子－1(IGF－1)缺乏、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)積累等因素都可以促進(jìn)糖尿病骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展［6，7］，成熟骨組織主要靠持續(xù)、循環(huán)性的破骨和成骨過程，由破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞協(xié)同完成。本研究結(jié)果提示，正常培養(yǎng)組成骨細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞伸出較多突起，有的突起相互連接，而高糖培養(yǎng)組成骨細(xì)胞不能伸展開，生長分散，同時(shí)堿性磷酸酶染色陽性率亦降低，顯示其增殖分化能力減弱，顯示高血糖狀態(tài)下成骨細(xì)胞減少及增殖分化能力減弱，造成成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的失衡，從而影響了骨組織的代謝，可能是造成糖尿病骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)原因。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示糖尿病大鼠存在軟骨下區(qū)成骨細(xì)胞核固縮、減少而破骨細(xì)胞生長活躍，骨小梁排列稀疏等明顯的骨質(zhì)疏松病理改變，同時(shí)成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶染色陽性率亦明顯降低，初步闡明了高血糖狀態(tài)下成骨細(xì)胞減少及增殖分化能力減弱，造成成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的失衡，從而影響了骨組織的代謝，為糖尿病性骨質(zhì)疏松癥的深入研究提供了一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

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