骨關節炎滑膜纖溶酶原激活物抑制因子的表達及意義

李茂強 朱六龍 邊振宇 季 成 陸 凱

骨關節炎的發病機制非常復雜，往往由多種因素引起。研究表明尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase－type plasminogen activator，uPA)及其受體可能與骨關節炎軟骨降解有關，而組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen actor，tPA)可能只參與局部纖溶平衡［1］。纖溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor，PAI)對 uPA、tPA 有明顯的抑制作用，但PAI在骨關節炎發生發展中的作用尚不明確，我們對滑膜中的兩種PAI進行檢測，結合相關文獻，探討其在骨關節炎的發病機制中的作用。

材料與方法

1．材料:選取2008年1月～2010年1月在筆者醫院行關節鏡清理術的40例骨關節炎患者，其中男性11例，女性29例，年齡37～74(59．6±6．40)歲;所有患者均經臨床及關節鏡確診，符合Altman診斷標準。10例膝關節創傷后行關節鏡診治術的患者做為對照組，既往無骨關節炎病史，關節鏡下無骨關節炎表現，其中男性8例，女性2例，年齡36～64(50．7±9.87)歲。兩組患者均于關節鏡術中用髓核鉗取關節滑膜3～5片，每片約2mm×3mm×1mm。

2．試劑和儀器:①一抗兔抗人 PAI－1、PAI－2、uPA、tPA多克隆抗體均購自武漢博士德公司，SP免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購自福州邁新公司;②主要儀器:關節鏡(Stryker 597T型)、石蠟切片機 (Leica2135型)、恒溫干燥箱(HG303型)、顯微鏡(OlympusCX31RBSF型)、微波爐(NNK 653S型)。

3．方法:所有組織標本一經取下立即用10%甲醛固定，常規石蠟包埋，5μm連續切片，分別行HE染色和PAI－1、PAI－2、uPA、tPA蛋白SP法免疫組化染色。結果判斷:①結合HE染色切片，根據蘇木素復染后的細胞形態，鑒別滑膜中的不同細胞類型;②用乳腺癌作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。細胞質和(或)細胞膜上出現明顯的棕色或棕黃色顆粒為陽性;③參照Szekanecz等［2］方法，根據10×40倍高倍鏡視野下滑膜組織中的陽性細胞占全部細胞(包括滑膜襯里細胞、滑膜下層單核細胞、巨噬細胞及血管內皮細胞)的比例計算百分比，陽性細胞數占總細胞數＞20%為陽性，對標本取5個不同視野計數，取其平均值。

4．統計學方法:χ2檢驗相關性分析，以p＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1．PAI－1在關節滑膜中的表達:PAI－1陽性表達反應定位于細胞質，呈黃色或棕黃色顆粒。40例骨關節炎滑膜中，PAI－1蛋白表達陽性26例，陽性表達率65%;10例對照滑膜中，PAI－1陽性1例(10%)。兩組比較差異有統計學意義(p＜0．05)，陽性細胞主要分布在滑膜襯里細胞，亦可見于滑膜下層單核細胞和血管內皮細胞(圖1A)。

2．PAI－2在關節滑膜中的表達:PAI－2陽性表達反應定位于細胞質，呈黃色或棕黃色顆粒。40例骨關節炎滑膜中，PAI－2蛋白陽性25例，陽性表達率62．5%。10例對照滑膜中，PAI－2陽性 1例(10%)，并且著色較淡。兩組比較差異有統計學意義(p＜0．05)，陽性細胞主要分布在滑膜襯里細胞(圖1B)。

3．uPA在關節滑膜中的表達:uPA陽性表達反應定位于細胞質，呈黃色或棕黃色顆粒(圖1C)。40例骨關節炎滑膜中，uPA蛋白陽性31例，陽性表達率77．5%。

4．tPA在關節滑膜中的表達:tPA陽性表達反應定位于細胞質，呈黃色或棕黃色顆粒(圖1D)。40例骨關節炎滑膜中，tPA蛋白陽性37例，陽性表達率92．5%。

圖1 骨關節炎滑膜免疫組織化學染色(SP法，×400)

5．PAI－1與uPA蛋白表達:陽性細胞百分比呈直線正相關(r=0．630，P ＜0．01);PAI－1 與 tPA 蛋白表達陽性細胞百分比呈直線正相關(r=0．417，p＜0.01);PAI－2與uPA、tPA蛋白表達陽性細胞百分比無直線相關關系。

討 論

絲氨酸蛋白酶通過多種方式促進細胞外基質和基膜的降解，參與纖溶、炎癥、細胞遷移等多種生理病理過程，uPA、tPA均屬于絲氨酸蛋白酶。在骨關節炎中，uPA對軟骨的降解在骨關節炎的發生發展中具有重要作用，而PAI是uPA、tPA的天然抑制因子，我們通過免疫組化的方法，觀察PAI在骨關節炎滑膜中的表達，探討其在骨關節炎發生發展中的作用。

PAI－1和PAI－2是正常血漿中纖溶酶原激活物(plasminogen activator，PA)的主要抑制因子，以PAI－1更為重要。PAI－1是由379個氨基酸組成的糖蛋白，分子質量約50kDa，能快速與uPA、tPA結合，抑制其活性，是人體纖溶系統的主要調節因子。關節滑膜成纖維細胞、內皮細胞、軟骨細胞等均能合成PAI－1和PAI－2，主要作用是維持局部PA/PAI系統的平衡［3］。IL－1、IL －6、TNF － α、粒細胞 － 巨噬細胞集落因子(GM－CSF)可在局部影響 PAI產生［4］。

研究表明，骨關節炎滑膜中uPA的表達與軟骨降解的程度密切相關，而PAI作為uPA的抑制因子，與軟骨降解之間的關系還未完全闡明［5］。本研究觀察到骨關節炎滑膜襯里層細胞可見PAI－1和PAI－2陽性表達，滑膜下層細胞、血管內皮細胞及單核－吞噬細胞亦出現陽性表達。雖然對照滑膜也檢測到其陽性表達，但強度較弱，并且陽性率與骨關節炎滑膜差異有顯著統計學意義。提示PAI和骨性關節炎關系密切，可能在骨關節炎發生發展中具有重要作用。

通過相關性分析，PAI－1與uPA、tPA蛋白表達陽性細胞百分比呈直線正相關;PAI－2與uPA、tPA蛋白表達陽性細胞百分比無直線相關關系。提示PAI，尤其是PAI－1在骨關節炎滑膜中維持PA/PAI平衡具有重要作用。PAI的增加是與PA系統相互作用的結果，骨關節炎滑膜中PA/PAI系統失去平衡后，PA增高，通過機體的反饋，導致PAI的增高，以適應局部的PA增高，在高水平達到新的平衡。PAI也對uPA有重要調節作用，與uPA和uPAR結合成復合物，通過細胞內吞作用，使uPA在溶酶體中降解，uPAR再次循環至細胞表面表達，通過此途徑可調節uPA的分泌和uPAR的表達。PAI和PA的相互作用，使PA/PAI處于一種動態平衡，致使組織降解不至于過于劇烈，骨關節炎的軟骨降解表現為長期慢性的過程可能與此有關。

研究表明，PAI具有許多獨立于PA的功能，如對血管生成的調節等。PAI在骨關節炎中表達的調控，亦可能有其獨立的激活機制，參與骨關節炎的形成及發展。

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2 Szekaneca Z，Haines GK，Koch AE．Differential expression of the urokinase receptor(CD87)in arthritic and normal synovial tissues［J］．J Clin Pathol，1997，50:314 －319

3 Cevinie MM，Generini S，Partsch G，et al．Synoviocytes from osteoarthritis and rheumatoid arthritis profuce plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor－1 and display u－PA receptors on their surface［J］．Life Sci，2008，63:441 －453

4 Mandl－Weber S，Haslinger B，Lederer SR，et al．Heat－ killed microorganisms induce PAI－1 expression in human peritoneal mesothelial cells:role of interleukin － 1alpha［J］．Am J Kidney Dis，2001，37(4):815－819

5 李茂強，李寬新，史晨輝，等．骨關節炎滑膜的uPA表達與關節軟骨破壞程度的相關研究［J］．中國內鏡雜志，2006，12(24):29－31