吸煙對氯吡格雷抗血小板活化作用的影響

徐 鵬 王寧夫 周 亮 葉顯華 童國新 冷建杭

最近有研究報告，由于吸煙具有促進氯吡格雷向活性產物轉化的作用，故吸煙可以使氯吡格雷抑制血小板聚集和活化的作用增強，而且冠心病的預后也顯著得到改善［1］。對這些研究結果的解釋和一些專家的觀點與以往吸煙有害的研究結論相矛盾，在學術界引起關注和爭論。然而，吸煙作為心血管疾病的獨立危險因子，其致病作用已得到明確證實，大量臨床研究顯示吸煙者患冠心病的危險是不吸煙者的1．5～4.0倍;吸煙者患心肌梗死的危險是不吸煙者的3倍左右。因此吸煙有益于增加氯吡格雷抑制血小板聚集和活化的結論有待于進一步驗證。本研究旨在驗證吸煙是否在冠心病患者冠狀動脈介入治療(PCI)術后近期有增強氯吡格雷抗血小板活化作用。

對象與方法

1．入選標準:隨機入選2009年2～10月在筆者醫院診斷為不穩定心絞痛初次擇期行冠脈造影的病人，符合冠脈介入治療(PCI)術標準并成功地行介入治療的病人分為吸煙組(22例)和非吸煙組(20例)。吸煙組的標準:吸煙1年以上并且近24h內吸煙，每日超過10支;非吸煙組的標準:既往無吸煙史和已經戒煙10年以上者。

2．排除標準:兩組均排除急性心肌梗死、既往吸煙但已戒煙或雖然未戒煙而近24h內未吸煙者、氯吡格雷過敏、過去兩個月內有獻血史、出凝血功能障礙、胃腸道手術史(闌尾切除術除外)、肝腎疾病、病毒性肝炎攜帶者、甲狀腺功能亢進或減退、腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病、有其他動、靜脈血栓疾病者及重度心力衰竭(NYHAⅣ級)。

3．服用藥物:所有患者入院后即頓服拜阿司匹林300mg、氯吡格雷300mg，隨后按拜阿司匹林100mg每天1次、氯吡格雷75mg每天1次服用，同時根據冠心病治療原則服用他汀、硝酸酯等藥物，有高血壓、糖尿病者繼續服用相關藥物;冠脈造影后如需行PCI術者，術后繼續服用氯吡格雷75mg每天1次、拜阿司匹林100mg每天1次。拜阿司匹林100毫克/片，產自德國拜耳公司，氯吡格雷75毫克/片，產自法國賽諾菲－安萬特公司。

4．樣本采集:所有患者入院后即采集外周靜脈血3ml;PCI術后患者在術后24、72h早晨空腹再次采集外周靜脈血3ml。將所采集的靜脈血加入3．13%枸櫞酸鈉(CTAD)抗凝管。

5．活化血小板的測定:熒光抗體染色:采用三色熒光染色，于FALCON試驗管中加入 PAC－1－FITC、CD62p－PE、CD61－PerCP抗體各20μl，各管分別加入混勻的全血5μl;在對照管中加入 PAC－1－FITC、IgG1－PE、CD61－per－cp各20μl及RGDS 10μl。室溫下避光孵育20min，加入2～8℃1%多聚甲醛(PFA)，充分混勻，陰暗處放置，24h內上流式細胞儀分析檢測。流式細胞儀(FCM):開機后以CaliBRITE3熒光微球和FACDComp自動軟件檢查儀器靈敏度，并自動設定實驗的獲取條件，包括光電倍增管(PMT)電壓和熒光補償等，然后以CellQuest軟件用樣本進一步優化實驗獲取條件，并檢測各組樣本管，獲取10000個細胞，最后用 CellQuest軟件分析CD61、CD62p陽性顆粒的百分率。所有試劑均由美國BD公司生產，固定液PFA由美國Sigma公司生產，FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司。

6．統計學方法:數據統計及計算使用SPSS 16．0完成，各組數據以均數±標準差表示，基線數據比較采用卡方檢驗，各組實驗數據間比較采用t檢驗，p＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1．基線情況:兩組在年齡、高血壓、高脂血癥、糖尿病、腦血管病及服用質子泵抑制劑(PPI)等方面的差距無明顯統計學意義(表1)。

2．服用氯吡格雷前和PCI術后24、72h的CD61、CD62p改變:服用氯吡格雷前和PCI術后24、72h的CD61、CD62p的各組數據資料見表2。

3．服用氯吡格雷前和PCI術后24、72h的CD61、CD62p表達率、差值的比較見表3。數據顯示，兩組術后24、72h的CD61、CD62p陽性表達率與術前比較無顯著改變;其中術后24h兩組的CD61、CD62p表達較術前均有下降的趨勢，但組間比較無明顯統計學差異;吸煙組在術后72h的CD61、CD62p表達較術前仍有下降趨勢，而非吸煙組已無下降表現，但是組間比較也無統計學差異。

討 論

煙草煙霧中的一氧化氮、一氧化碳、氧自由基等物質損害血管內皮、增加血液黏稠度和血小板聚集、活化的能力、促進血栓形成，誘發或加劇心血管疾病，不論主動還是被動吸煙者，心血管疾病都明顯增加。吸煙作為心血管疾病的獨立危險因子，其致病作用已得到明確證實，但是近期對一些吸煙與血栓的臨床試驗結果的解釋造成一些學術爭論。CLARITY－TIMI 28試驗的結果分析發現，氯吡格雷降低了冠脈造影前總體梗死相關的主要終點事件和病死率，但吸煙≥10支/天者獲益要明顯高于不吸煙者;同樣，氯吡格雷在降低30天全因死亡、心肌梗死和急性血運重建方面，吸煙≥10支/天者也優于不吸煙者［1］。Jeong等［2］對138名急性心肌梗死并且進行支架置入的患者進行研究，發現每日抽煙≥10支的患者其5和20μmol/L ADP誘導下的血小板聚集率都明顯低于非吸煙者(40．9% ± 16．1%vs 46．6% ± 11.7%，P=0.028，53．8% ± 16．6%vs 59．2% ± 12．2%，P=0.040)，在吸煙的健康志愿者和急性ST段抬高性心肌梗死患者身上發現氯吡格雷的抗血小板作用有增加的表現。

對此類研究結果如何解釋是目前學術爭論的焦點。一些作者認為吸煙促進了氯吡格雷向其活性成分的轉化。氯吡格雷屬第2代噻吩吡啶類藥物，其原藥無活性，體內經肝臟細胞色素P450轉化的代謝物方具抗血小板聚集活性。Yousef等［3］觀察了正常志愿者吸煙對氯吡格雷藥代動力學的影響，發現相對非吸煙者，吸煙者的氯吡格雷(原形及無活性羧酸代謝產物)曲線下面積(AUC)下降30%，半衰期下降35%，而血漿峰值濃度和達峰值濃度的時間無差異。研究發現吸煙可以干擾 CYP亞型，誘導CYP1A2、CYP2C19等的表達，從而促進氯吡格雷向活性產物方向的代謝［4，5］。

事實上，吸煙是否增加氯吡格雷的抗血小板作用，學術界也有一定的爭議，Cho等［6］的相關研究證實在急性心肌梗死患者中吸煙與血小板活性的降低沒有相關性，而PCI術后吸煙≥10支/日的患者氯吡格雷也沒有進一步降低血小板活性。

另一種觀點認為吸煙本身有急性誘導血小板聚集的作用，氯吡格雷阻斷血小板聚集作用的增強是一種對吸煙者造成凝血功能失調的的反應，在某種程度上也表明吸煙者與非吸煙者可能在血栓發生機制上有所不同，吸煙者更需要氯吡格雷治療。Addad等［7］對穩定型冠心病患者的研究證實這一觀點。Cucina等［8］研究證實煙草中的尼古丁可以增加血管內皮細胞和巨核細胞表面P2Y12受體的表達，雖然該實驗沒有直接有關于血小板的數據，因為血小板由成熟的巨核細胞脫落而來，故推測血小板分泌的ADP表面P2Y12受體表達也因吸煙而增加，從而使氯吡格雷的抗血小板作用增加。

本實驗采用常用的血小板活化標志物CD61、CD62p作為觀測血小板活化程度的指標。Cd61是血小板膜糖蛋白Ⅲa(GPⅢa)代表的CD抗原，與GPIIb構成GPⅡb/Ⅲa復合物，是血小板含量最多的糖蛋白，研究證實GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原的結合是血小板聚集的最后通路［9］。CD62p是α顆粒膜表面的糖蛋白GMP－140代表的CD抗原，又稱P－選擇素，其在血小板質膜上的表達或其陽性血小板的百分率的增加被認為是活化血小板的特異性標志物［10］;CD62p的強表達在血小板活化后10min時出現，活化有賴于 GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原的結合，因此CD62p是血小板活化的晚期標志物［11］。本試驗數據顯示PCI術前、術后兩組間CD61、CD62P的表達沒有明顯差異，術后24h的CD61、CD62P的表達較術前有所下降(CD61:－1．16% ±19．06%vs －0．98% ±22．19%，P=0．36;CD62p:－ 1．93% ± 10．80%vs－2．07% ±15．49%，P=0．96)，可以認為與氯吡格雷的抗血小板作用有關;術后72h吸煙組的CD61、CD62P的表達較術前仍略有下降，非吸煙組則不再降低(CD61:－2．19% ±21.72%vs 5．27% ±26.58%，P=0．46;CD62p:－6．13% ±18.74%vs 0．12% ±12.78%，P=0．25)，兩組間比較沒有統計學意義。即本實驗的結果顯示吸煙未能增強冠心病患者PCI術后早期氯吡格雷的抗血小板活化作用。

本實驗未能進一步驗證CLARITY－TIMI 28等試驗的結論，可能的原因有:①吸煙增強氯吡格雷抗血小板作用，同時也增加了血小板活化能力，兩者的作用有所抵消;②CLARITY－TIMI 28等試驗中未進一步明確入院及隨訪過程中的戒煙情況，不良終點事件的減少還可能與戒煙本身有關，因為終點事件的減少與吸煙的數量明顯相關;③上文中提到的一些氯吡格雷相關的試驗是在健康志愿者或者體外完成的，且氯吡格雷存在較大的個體差異性，吸煙對氯吡格雷抗血小板作用的影響究竟如何，目前尚缺乏大規模臨床證據。

因為目前關于吸煙對氯吡格雷抗血小板作用方面的實驗不多，而且相關試驗中以CD61、CD62p等標志物來測定血小板作用的報道較少。由于受樣本偏少、患者合并高血壓等疾病的影響及入院后短期減少或停止吸煙等因素的影響，本研究結果有一定的局限性。因此，吸煙是否可以增加氯吡格雷的抗血小板作用，還需大樣本的臨床觀察以進一步明確。

本實驗表明吸煙的冠心病患者未發現PCI術后早期氯吡格雷的抗血小板活化作用增強，因此本實驗未能驗證吸煙能增加冠心病患者PCI術后近期氯吡格雷的抗血小板活化作用這一結論。關于吸煙者PCI術后服用氯吡格雷是否有額外臨床獲益的問題，本文未做探討，還需大樣本的臨床觀察以進一步澄清。

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