缺血預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

胡躍強(qiáng) 唐 農(nóng) 董少龍 劉尊敬 祝美珍 胡玉英 王棕可

(廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530023)

腦缺血預(yù)處理(BIP)是指對腦組織采用機(jī)械刺激，如一次或多次短暫性腦缺血再灌注后，誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，使其對以后較長時間的缺血性損傷產(chǎn)生顯著的耐受。這種現(xiàn)象又稱為腦缺血耐受(IT)。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠局灶性BIP模型，以觀察BIP對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 健康雄性SD大鼠60只，體重(250±50)g，隨機(jī)將大鼠分為三組:假手術(shù)組、大腦中動脈缺血再灌注組(MCAO)、假手術(shù) +腦缺血組;BIP組:預(yù)缺血+腦缺血組(BIP+MCAO);每組按照再缺血后12 h、1、2、3 d四個時間點(diǎn)平均分為4個亞組(n=5)。分別作如下處理:假手術(shù)組:以假手術(shù)代替預(yù)缺血及缺血再灌注;MCAO組:以假手術(shù)代替預(yù)缺血，其余步驟同BIP組;BIP組:MCAO 10 min后抽出栓線，完成預(yù)缺血，3 d 后再次行 MCAO 2 h，再灌注后12 h、1、2、3 d 處死大鼠。

1.2 動物模型及標(biāo)本制備 參照Longa的線栓法進(jìn)行造模。采用大腦中動脈二次線栓法〔1〕制備大鼠腦缺血預(yù)處理模型，結(jié)扎大鼠左頸外動脈遠(yuǎn)端和頸總動脈近端，將前端用火焰燒圓的尼龍線從頸總動脈殘端插入，進(jìn)線約18～20 mm，MCAO后10 min抽出線栓，完成預(yù)缺血。3 d后再次行MCAO 2 h，再灌注后規(guī)定時間點(diǎn)心腔內(nèi)抽取動脈血，凝固后立即以3 000 r/min離心15 min，取上血清-80℃保存?zhèn)錅y，并同時處死動物取腦。

1.3 觀察指標(biāo) ①神經(jīng)細(xì)胞凋亡率檢測:大鼠迅速斷頭取腦，分離缺血半暗帶腦組織100 mg，1.25 g/L胰蛋白酶消化后制備單細(xì)胞懸液，70%乙醇4℃過夜固定樣品，次日離心棄乙醇收集細(xì)胞，加入50 mg/L RNase，37℃孵育30 min，再加入50 mg/L碘化丙啶，4℃避光染色30 min，300目篩網(wǎng)過濾，利用美國貝克曼-庫爾特FC 500流式細(xì)胞儀計數(shù)10 000個細(xì)胞，測定各期細(xì)胞DNA含量并計算凋亡細(xì)胞所占比例。②血清NSE濃度測定:采用雙抗夾心ELISA法檢測大鼠血清中的NSE含量。按試劑盒說明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期定量分析表明，假手術(shù)組未見明顯的凋亡峰，其細(xì)胞凋亡百分率很低。腦缺血再灌注12 h后，MCAO組細(xì)胞凋亡發(fā)生率較假手術(shù)組顯著增加(P＜0.01)，1 d時達(dá)到高峰，以后時間點(diǎn)逐漸下降，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.01);BIP組各個時間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡發(fā)生率較MCAO組顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。說明BIP具有減輕腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的作用。見表1。

2.2 血清NSE濃度測定結(jié)果 假手術(shù)組大鼠血清NSE含量很低;大鼠腦缺血再灌注后12 h血清中NSE的含量明顯升高(P＜0.01)，至缺血1 d達(dá)到高峰，以后時間點(diǎn)逐漸下降，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.01);BIP組各個時間點(diǎn)血清 NSE較MCAO組顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表1 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較(s，%，n=5)

表1 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較(s，%，n=5)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與MCAO組同時間點(diǎn)比較:2)P＜0.05，3)P ＜0.01

12 h 24 h 2 d 3 d假手術(shù)組組別4.5±1.4 5.0±1.8 4.6±1.2 5.2±1.6 MCAO組 34.6±11.51)48.2±12.41)38.7±14.61) 29.2±9.31)BIP組 25.3±9.02) 36.4±10.93)30.8±11.22) 22.5±8.72)

表2 各組大鼠血清NSE比較( s，pg/ml，n=5)

表2 各組大鼠血清NSE比較( s，pg/ml，n=5)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與MCAO組同時間點(diǎn)比較:2)P＜0.05

12 h 24 h 2 d 3 d假手術(shù)組組別8.73±2.93 9.68±3.55 10.06±3.19 8.65±3.02 MCAO組19.06±6.541)30.45±9.801)25.90±7.661)18.83±5.751)BIP組 14.50±4.262)23.19±5.382)19.64±4.922)13.66±3.872)

3 討論

自1990年Kitagawa〔2〕發(fā)現(xiàn)缺血耐受以來，對腦缺血防治的認(rèn)識開辟了新的領(lǐng)域，為腦保護(hù)提供了新的思路，這種通過激發(fā)機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，以增強(qiáng)對下一次嚴(yán)重?fù)p傷的抵抗能力的方法受到廣泛關(guān)注，目前被認(rèn)為是最強(qiáng)的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。研究表明〔3〕:單次或多次累積時間20～30 min的短暫局灶缺血為最佳耐受誘導(dǎo)劑，可使缺血面積減少達(dá)30%，另有實(shí)驗(yàn)表明:亞致死性缺血預(yù)處理的暴露時間與誘導(dǎo)耐受形成的間歇期，對再次長時間致死性缺血損害的耐受持續(xù)時間呈劑量反應(yīng)曲線關(guān)系。缺血預(yù)處理耐受機(jī)制目前仍不十分清楚，研究表明耐受是涉及遞質(zhì)、受體、通道、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成的多環(huán)節(jié)調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程。多數(shù)人認(rèn)為它的一般機(jī)制為〔3，4〕:缺血預(yù)處理可引起組織釋放以腺苷為主的內(nèi)源性遞質(zhì)，并與相應(yīng)的受體結(jié)合，通過激活信號傳導(dǎo)通路來啟動特定的基因，表達(dá)出具有保護(hù)作用的效應(yīng)物，抑制神經(jīng)細(xì)胞的壞死或凋亡，從而發(fā)揮對神經(jīng)元的保護(hù)作用。Prasad等〔5〕研究表明，腦缺血預(yù)處理可通過激活PI3K-Akt途徑發(fā)揮抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用。Du等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)MLK3信號途徑在大鼠腦缺血預(yù)處理細(xì)胞凋亡保護(hù)中發(fā)揮重要作用。

本研究采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，該方法較原位末端標(biāo)記、DNA凝膠電泳、形態(tài)學(xué)觀察等方法具有定量精細(xì)且可避免壞死細(xì)胞干擾的優(yōu)點(diǎn)。本研究提示BIP誘導(dǎo)了腦組織產(chǎn)生某種抗凋亡機(jī)制，抑制了再次缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

NSE是糖酵解過程中的一種關(guān)鍵酶，特異地存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，在大腦中含量最高，性質(zhì)穩(wěn)定。在缺血性腦損害神經(jīng)元變性壞死后，NSE可釋放出來，透過血腦屏障進(jìn)入血液中，因而血液中NSE水平可以反映腦損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報道結(jié)果相一致〔7〕。

綜上，BIP可以抑制腦缺血損傷后細(xì)胞凋亡和壞死，進(jìn)而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用，減輕隨后發(fā)生的更為嚴(yán)重的致死性缺血性腦損傷。這些有助于進(jìn)一步了解BIP的作用機(jī)制，且對于尋找腦保護(hù)的有效途徑具有積極意義，其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

1 郝玉曼，羅祖明，周 東.局灶預(yù)缺血誘導(dǎo)腦缺血耐受的動物模型〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2003;20(2):129-30.

2 Kitagawa K，Matsumoto M，Tagaya M，et al.“Ischemic tolerance”phenomenon found in the brain〔J〕.Brain Res，1990;528(1):21-4.

3 Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy:ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2006;26(9):1114-21.

4 Steiger HJ，Honggi D.Ischemic preconditioning of the brain，mechanisms and applications〔J〕.Acta Neurochir(Wien)，2007;149(1):1-10.

5 Prasad SS，Russell M，Nowakowska M.Neuroprotection induced in vitro by ischemic preconditioning and postconditioning:modulation of apoptosis and PI3K-Akt pathways〔J〕.J Mol Neurosci，2011;43(3):428-42.

6 Du Y，Li C，Hu WW，et al.Neuroprotection of preconditioning against ischemic brain injury in rat hippocampus through inhibition of the assembly of GluR6-PSD95-mixed lineage kinase 3 signaling module via nuclear and non-nuclear pathways〔J〕.J Neurosci，2009;161(2):370-80.

7 金麗英，劉真友，楊學(xué)偉，等.兔腦缺血再灌注后NSE和S-100的表達(dá)及其血清水平的變化〔J〕.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2007;22(11):964-7.