原發(fā)性肝癌組織中螺桿菌感染狀況分析

楊吉利 季尚瑋 張永貴 李紅艷 王江濱 (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春 130033)

目前認(rèn)為原發(fā)性肝癌最常見的病因為HBV和HCV感染，其次還與黃曲霉素、酒精、自身免疫等因素有關(guān)。但是盡管存在同樣的致癌因素，其臨床表現(xiàn)及預(yù)后也相差甚遠(yuǎn)。因此，除與上述致癌因素的致病強度及宿主免疫狀況等因素密切相關(guān)外，是否還存在其他協(xié)同致病因素，如細(xì)菌感染等，一直是人們關(guān)注的焦點。自1982年Warren和Marshall首次發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌(H.pylori，Hp)以來，臨床及實驗研究已證實Hp感染與多種胃腸外疾病密切相關(guān)〔1～6〕。國外學(xué)者在人類慢性肝病患者的肝組織及膽管組織中均發(fā)現(xiàn)了螺桿菌菌屬DNA，證實了螺桿菌參與人類肝膽系統(tǒng)疾病的發(fā)生〔7，8〕。本實驗室也先后在慢性肝病組織中擴增出螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因〔9〕。本文旨在進一步探討螺桿菌與原發(fā)性肝癌的關(guān)系及螺桿菌在人類肝癌中的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選擇2008年1月至2011年10月吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院及吉林省腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除及肝穿刺活檢確診為原發(fā)性肝癌的患者36例，男29例，女7例，年齡36～79〔平均(59±13.2)〕歲。按病因分類，合并病毒性感染27例 ，合并酒精性肝炎5例，病因不明肝癌4例。對照組為同期住院的性別和年齡相匹配的肝臟外傷患者29例，所有患者除外慢性病毒性肝炎、肝硬化、嗜酒、藥物及自身免疫性疾病及代謝性疾病等因素。兩組病例半年內(nèi)均未接受過抗生素治療。

1.2 肝組織取材 4塊肝組織均來自彩超引導(dǎo)下肝臟穿刺活檢或手術(shù)切除所得，其中1塊-80℃低溫保存，用于螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因擴增;2塊置于10%甲醛液中固定，用于病理組織學(xué)檢查;1塊保存于含30%甘油及5%小牛血清的布氏肉湯中-80℃保存，行螺桿菌的分離培養(yǎng)及鑒定。

1.3 肝癌組織螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因檢測

1.3.1 肝臟組織DNA提取 肝臟組織DNA提取采用3S柱式提取法。試劑盒由上海生工生物工程有限公司提供。

1.3.2 PCR擴增 PCR反應(yīng)總體系為 50 μl，包括 Taq DNA聚合酶 2.5 U(0.5 μl)，10 × Buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl2，3.6 μl(終濃度為 1.8 mmol/L)，10 mmol/L dNTPs 1 μl(終濃度為 200 μmol/L)，25 μmol/L 引 物 各 1 μl(終 濃 度 分 別 為0.5 mmol/L)，DNA模板1 μl。螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因引物序列及PCR反應(yīng)條件見表1。

表1 螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因引物序列及PCR反應(yīng)條件

1.3.3 電泳分析 分別取螺桿菌菌屬特異性16 S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物10 μl加入2 μl溴酚藍(lán)混合均勻，點樣于含0.2%溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠中，100 V直流電電泳30 min，然后紫外燈下觀察結(jié)果，并應(yīng)用紫外成像系統(tǒng)照相。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗。應(yīng)用SPSS11.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性肝癌患者肝組織中螺桿菌菌屬16S rRNA基因分析 對36例原發(fā)性肝癌患者的肝組織DNA采用螺桿菌16S rRNA基因通用引物進行巢式 PCR擴增。結(jié)果有 23例(63.9%)肝癌患者的肝組織檢測到螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因，而正常肝組織中僅3例(10.3%)為陽性。兩組比較有顯著差異(χ2=19.18，P＜0.001)。見圖1。

圖1 原發(fā)性肝癌組織與正常肝組織中螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因擴增電泳圖

2.2 原發(fā)性肝癌組織中螺桿菌感染狀況與肝臟基礎(chǔ)疾病的相關(guān)性分析 為探討螺桿菌感染與原發(fā)性肝癌基礎(chǔ)疾病的關(guān)系，將肝癌組分為合并病毒性肝炎組、合并酒精性肝炎組、其他組。結(jié)果顯示：在27例合并病毒感染者中，螺桿菌特異性16S rRNA基因陽性者17例(62.9%);在5例合并酒精性肝炎患者中，螺桿菌16S rRNA基因陽性者4例(80.0%);其他原因者2例(50.0%)。各組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 肝癌組織螺桿菌的分離培養(yǎng)及鑒定 為了證實原發(fā)性肝癌患者的肝組織中是否有活體螺桿菌菌體的存在，將36例原發(fā)性肝癌患者的肝組織進行螺桿菌分離培養(yǎng)3～10 d，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)可疑菌落生長。

3 討論

1992年Fox等〔10〕發(fā)現(xiàn)H.hepaticus與 A/J Cr小鼠的慢性肝損傷，甚至肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。其后，生物學(xué)界開始展開了關(guān)于螺桿菌屬與人類慢性肝病之間關(guān)系的研究。隨著對螺桿菌菌屬研究的不斷深入，科學(xué)家們相繼在人類原發(fā)性肝癌組織、丙型肝炎、肝硬化肝組織及膽管癌組織和膽汁中發(fā)現(xiàn)了螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因。Pellicano等〔7〕對23例HCV相關(guān)性肝癌患者和6例胃腸道惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移患者的肝臟組織進行螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因檢測，結(jié)果顯示23例肝癌組織中有17例(85%)發(fā)現(xiàn)螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因，而6例肝轉(zhuǎn)移癌組織中僅有2例發(fā)現(xiàn)螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因。Rocha等〔8〕對109例丙型肝炎后肝硬化患者的肝組織進行螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因檢測，發(fā)現(xiàn)伴有肝癌組、不伴肝癌的肝硬化組螺桿菌16S rRNA基因陽性率分別為68.0%、61.3%，而單純慢性肝炎組和對照組螺桿菌16S rRNA基因陽性率分別為4.2%、3.5%。提示螺桿菌感染可導(dǎo)致臟臟結(jié)構(gòu)變化，可能是HCV相關(guān)性慢性肝病的協(xié)同危險因素〔11〕。日本學(xué)者通過血清抗H.hepaticus抗體檢測提示，在乙肝、丙肝、肝硬化患者中H.hepaticus感染率明顯高于健康人群〔6〕。還有學(xué)者在膽石癥患者的膽汁中檢測肝螺桿菌陽性率41%，在膽囊炎合并胃癌的患者中肝螺桿菌陽性率36%，明顯高于無膽道疾病的患者〔12〕。本實驗室也先后在慢性病毒性肝炎、肝硬化患者的肝組織中擴增出螺桿菌菌屬特異性16S rRNA基因。

本結(jié)果提示螺桿菌在原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色，肝炎病毒、酒精等伴隨因素并不是影響螺桿菌感染肝癌患者的主要因素。綜上所述，本研究表明螺桿菌感染可能是原發(fā)性肝癌重要生物學(xué)因素之一。但具體菌種尚需進一步鑒定，而且關(guān)于肝螺桿菌誘發(fā)肝細(xì)胞癌的發(fā)生機制還不太清楚，這些均有待進一步研究。

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8 Rocha M，Avenaud P，Ménard A，et al.Association of Helicobacter species with hepatitis C cirrhosis with or without hepatocellular carcinoma〔J〕.Gut，2005;54：396-401.

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