體外轉染Klotho基因對H9c2(2-1)大鼠心肌細胞缺血再灌注的影響

李寶善 馬厚勛 王艷嬌 吳 平 (重慶醫科大學附屬第一醫院老年病科，重慶 400016)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指缺血的心肌在成功恢復心臟血供的同時，血液循環中白細胞附壁、聚積，滲出血管而浸潤心肌，導致心肌細胞壞死，加之補體激活以及活性氧的產生，致使心肌損傷更為嚴重，出現心肌舒縮功能降低、再灌注心律失常、梗死面積擴大等現象。隨著經皮冠狀動脈腔內成形術、冠脈內支架置入術等新療法的廣泛應用，MIRI越來越常見，并在缺血性心臟病病程中扮演了重要的角色，被認為是心肌保護問題的關鍵〔1〕。為此我們利用基因轉染技術將Klotho基因轉染至H9c2(2-1)大鼠心肌細胞，探討轉染Klotho基因對大鼠心肌細胞MIRI的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 質粒載體pAAV-MCS為Stratagene公司產品。RNAiso Plus、各種限制性內切酶、PrimeScript?RT reagent Kit、Premix Taq?Version2.0(Loading dye mix)、DNA Marker、T4 DNA連接酶為TakaRa公司產品，膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自Omega公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。DMEM高糖培養基為美國Gibco公司產品。Fermentas轉染試劑為美國MBI公司產品。H9c2(2-1)大鼠心肌細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。胎牛血清購自Hyclone公司。兔抗人、鼠Klotho抗體購自Abcam公司，FITC標記山羊抗兔IgG為博奧森公司產品。LDH與MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。昆明小鼠購自重慶醫科大學實驗動物中心。免疫染色固定液、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、抗淬滅封片液均為碧云天公司產品。

1.1.2 主要儀器 Nano Drop2000微量分光光度計(Thermo)，s1000 PCR儀、DNA電泳凝膠成像系統(Bio-Rad)，Leica DM6000B熒光顯微鏡，HEPA Class100 3131型三氣恒溫細胞培養箱(Thermo)，SpectraMax M2e酶標儀(Molecular Devices)。

1.2 重組pAAV/Klotho質粒構建 參考趙景宏等〔2〕研究方法改進。

1.4 重組pAAV/Klotho質粒的構建 將PCR產物經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定片段大小，膠回收3 kb左右條帶。EcoR I/Xho I分別對腺相關病毒空載體pAAV-MCS進行雙酶切，膠回收目的片段，然后將酶切后載體與之前酶切回收cDNA片段按1∶10(摩爾數比)進行連接，連接產物轉化TOP10感受態細胞，轉化后細胞涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養基平板上，37℃培養過夜。

1.5 重組pAAV/Klotho質粒的篩選與鑒定 經含氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落于37℃振蕩培養過夜后提取質粒，通過EcoR I/Xho I酶切對陽性重組質粒pAAV/Klotho進行鑒定。最終將鑒定陽性重組質粒送上海生工生物工程公司進行DNA測序，測序結果與GenBank中所報道目的基因序列進行比對和分析。

1.6 H9c2(2-1)細胞培養 用含10%胎牛血清的DMEM(高糖)培養基，25 cm2羅口培養瓶，5%CO2孵箱培養。

1.7 H9c2(2-1)細胞缺血再灌注模型復制 用以高純N2飽和、缺氧(1%O2)、無糖、缺鈣的 D-hank液模擬缺血溶液，待H9c2(2-1)細胞生長至鋪滿80%時置換正常培養液，放人缺氧培養箱中4 h模擬缺血，再以含20%血清的正常培養液置換缺血溶液，開放培養于正常培養箱中12 h模擬再灌注〔3〕。

1.8 基因轉染 參照Fermentas轉染試劑說明進行。

1.9 實驗分組 A.對照組(Control)：不轉基因，常氧培養64 h;B.模擬I/R組(I/R組)：不轉基因，常氧培養48 h后模擬I/R;C.轉染Klotho基因組(Klotho組)：以Fermentas轉染試劑為載體轉染Klotho基因，常氧培養48 h后模擬I/R;D.轉染空載體組(Vehicle control組)：不轉基因，空載體，常氧培養48 h后模擬I/R;每組重復5次。

1.10 心肌細胞Klotho mRNA水平檢測 各實驗組細胞按RNAiso Plus說明書提取總RNA，溶于 DEPC處理水。Nano Drop2000微量分光光度計測濃度在 0.5 μg/μl以上，A260/A280在1.9左右。按 PrimeScript?RT reagent Kit說明，10 μl體系加1 μg總RNA逆轉錄。以逆轉錄所得cDNA為模板，用Premix Taq?Version2.0(Loading dye mix)PCR擴增，所用上、下游PCR引物序列分別為5'GGGTCACTGGGTCAATCT3'和5'GCAAAGTAGCCACAAAGG3'(NCBI Reference Sequence：NM_013823.2)，PCR產物長度為710 bp。內參同前。

1.11 Klotho蛋白表達檢測(免疫熒光法)待各實驗組培養細胞爬片，融合60%左右時固定20 min、PBS洗4遍，封閉60 min，結合一抗(1∶37.5)4℃過夜。PBS洗 4遍，1∶75二抗37℃孵育1 h，抗淬滅封片液封片，Leica正置熒光顯微鏡觀察并采圖。

1.12 ELISA檢測各實驗組細胞培養的上清液Klotho蛋白水平 按ELISA試劑盒說明書操作。

1.13 細胞損傷指標的檢測 ①MTT比色法檢測細胞活性：細胞培養液中加入MTT溶液，37℃、5%CO2培養箱孵育4 h，加DMSO，輕搖10 min，測各孔吸光度值(OD值)。以對照組OD值均數為對比計算細胞活性：細胞活性=各孔OD值/對照組OD值均數。②LDH活性檢測：按試劑盒說明進行操作，酶標儀檢測吸光度值。③丙二醛(MDA)含量：操作方法參照試劑盒說明書，721紫外分光光度儀檢測吸光度值。

2 結果

2.1 pAAV/Klotho質粒構建 以昆明小鼠腎臟總RNA為模板，通過RT-PCR技術克隆Klotho cDNA全長，EcoR I/Xho I雙酶切，連接載體pAAV-MCS。經含氨芐青霉素抗性篩選，挑取單菌落于37℃振蕩培養過夜后提取質粒，通過EcoR I/Xho I酶切對陽性重組質粒pAAV/Klotho進行鑒定。陽性重組質粒EcoR I/Xho I雙酶切后可見約4.7 kb載體片段和約3 kb Klotho cDNA片段(見圖1)。將酶切鑒定陽性重組質粒送上海生工生物工程公司進行DNA測序，測序結果與GenBank中所報道目的基因序列完全一致。

2.2 RT-PCR檢測各組Klotho mRNA表達情況 結果發現各實驗組均有Klotho mRNA表達，但Klotho轉染組Klotho mRNA表達水平明顯高于其他組，其余各組間無顯著性差異。說明Fermentas轉染試劑為載體轉染小鼠Klotho cDNA成功，有效使心肌細胞Klotho mRNA表達顯著上調(如圖2)。

圖1 pAAV/Klotho載體酶切鑒定

2.3 免疫熒光法檢測各組Klotho蛋白表達情況 免疫熒光法檢測結果顯示各組細胞膜及胞漿中 Klotho蛋白表達，其中Klotho轉染組熒光表達較其他細胞組多，熒光強度更強，說明轉染成功，結果滿意。

2.4 各組細胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量檢測結果 I/R后，細胞活性較正常對照組低，反映細胞損傷的指標LDH、MDA明顯較正常對照組高(P＜0.01)。在I/R的三組中，Klotho轉染組(C組)其細胞活性高于I/R對照組(B組)和空載體轉染組(D組);而其反映細胞損傷的指標LDH、MDA明顯低于I/R對照組(B組)和空載體轉染組(D組)(P＜0.01)。細胞培養上清液中檢測到的Klotho蛋白主要為分泌型Klotho蛋白，Klotho轉染組的細胞培養上清液中分泌型Klotho蛋白含量明顯高于其他三組(P＜0.01)。見表1。

圖2 RT-PCR結果

圖3 Klotho蛋白免疫熒光圖

表1 各組細胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量檢測結果( s，n=5)

表1 各組細胞活性、LDH、MDA、Klotho蛋白含量檢測結果( s，n=5)

與A組相比：1)P＜0.01;與B組相比：2)P＜0.01;與D組相比：3)P＜0.01

組別 細胞活性(%)上清液LDH含量(U/L)上清液MDA含量(nmol/L)上清液Klotho蛋白含量(U/L)A 100±0 83.75±1.70 1.59±0.07 49.70±4.44 B 68.14±7.401) 218.45±2.791) 2.95±0.151) 45.63±0.811)C 81.32±9.931)2)3)122.15±6.461)2)3)0.53±0.081)2)3)76.85±10.881)2)3)D 69.54±9.211) 206.84±21.761) 2.66±0.351) 45.23±1.651)

3 討論

Klotho基因是1997年由Kuro等〔4〕首先從衰老表現的模型小鼠中克隆成功，并以古希臘神話紡織生命之線女神的名字-Klotho來命名。研究發現該基因表達缺陷的小鼠會出現類似人衰老的一系列表型變化，動脈硬化和異位鈣化、糖和能量代謝異常生殖器官萎縮、骨質疏松、肺氣腫等。Klotho基因全長50 kb，包含5個外顯子，4個內含子，在人類Klotgo基因定位于第13號染色體(13q12)，其可通過選擇性拼接產生兩種蛋白產物(Klotho)：一種為膜型Klotho蛋白，屬于一種單次跨膜蛋白，其全長為1 012個氨基酸，主要在腎臟的遠曲小管細胞及腦脈絡叢等表達，其作為成纖維細胞生長因子23(fibroblasts growth factor 23，FGF23)專一性復合受體的主要成分而發揮其重要生理調節作用;另一種為分泌型Klotho蛋白，該類型缺乏跨膜結構和胞內結構區，全長為549個氨基酸，在小鼠血液、尿液及腦脊液中均能被檢測到。

跨模型Klotho蛋白通過與Na+-K+ATP酶α1亞基結合，增加該亞基在細胞表面數量來實現其對細胞外鈣濃度降低的應答反應〔5〕，具有調節離子通道活性;分泌型Klotho作為一種循環因子或激素，抑制細胞內胰島素/胰島素樣生長因子-1(insulin/IGF-1)信號級聯放大效應〔6〕，可抑制胰島素/IGF-1信號通路;還可以抑制氧化應激以及Wnt信號轉導〔7，8〕，并具有調節一氧化氮合成的作用。

本研究結果證明Klotho蛋白對H9c2(2-1)大鼠心肌細胞缺血再灌注具有很好的保護作用。本實驗證實了Klotho的抗氧化應激作用，由此推測Klotho對H9C2(2-1)大鼠心肌細胞缺血再灌注的保護作用機制可能與抗氧化應激有關，是否還與Klotho調節心肌細胞膜離子通道活性、抑制胰島素/IGF-1信號通路、抑制Wnt信號轉導以及一氧化氮合成等作用有關，還有待證實。

目前基因治療所用的基因載體主要有病毒和非病毒兩類。非病毒載體脂質體具有下列優點：①易于制備，使用方便，可攜帶大的DNA片斷;②毒性、免疫原性低;③可防止攜帶DNA被體內物質降解，可將其特異性傳遞到靶細胞中;④離體細胞可以瞬間表達外源基因〔9～11〕。本實驗中使用的脂質體是新一代產品——Fermentas轉染試劑，用其轉染不受血清的干擾，轉染操作更為方便。實驗結果表明該Fermentas轉染試劑介導的外源基因得到了有效表達。

總之，通過Fermentas轉染試劑可以穩定地把Klotho基因轉入H9c2(2-1)細胞，轉染Klotho基因則可減輕H9c2(2-1)細胞模擬I-R損傷，對H9c2(2-1)細胞具有保護作用;同時本研究為探討Klotho基因對缺血性心臟病的治療作用、提高其安全性提供了可行的實驗依據。

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