淫羊藿苷通過雌激素受體和p38MAPK信號誘導MC3T3-E1Subclone14細胞的分化

朱曉峰 張榮華 孫升云 王廷春 王攀攀 楊 麗 韓 莉

(暨南大學附屬第一醫院中醫科，廣東 廣州 510630)

淫羊藿苷(ICA)為淫羊藿的主要活性成分，也是對含淫羊藿藥物質量控制的主要指標性成分〔1〕，分子式為C33H40O15，結構上屬于8-異戊烯基黃酮醇苷類化合物。目前研究發現ICA有多種藥理活性，尤其對骨代謝的作用研究較多，已有的結果顯示ICA可以促進成骨細胞和間質干細胞分化〔2，3〕，抑制破骨細胞的分化和成熟〔4〕，但對其具體的作用靶點和作用機制缺乏進一步研究。雌激素受體(ER)信號通路和p38MAPK信號和成骨細胞的分化有著密切關系，一些植物的活性成分顯示可以通過這兩個信號影響成骨細胞分化〔5，6〕，那么ICA是否有類似作用，ER信號通路和p38MAPK信號有無聯系?本研究的實施可以為淫羊藿的補腎壯骨作用提供部分細胞分子學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 無酚紅的αMEM(Gibco);碳吸附的胎牛血清(FBS)(Biological Industries);抗壞血酸(Vit C)、二甲基亞砜(DMSO)、pNPP、茜素紅(Sigma);ICI182780(Tocris Cookson);WST-8試劑盒(GEMED基因);BCA蛋白檢測試劑盒(凱基生物科技);I型膠原(Col I)ELISA試劑盒(森雄科技);骨鈣素(BGP)ELISA試劑盒購于(西唐生物科技);ECL發光試劑盒(PIERCE);PMSF(Sigma);β-tublin兔抗小鼠一抗(Cell signal);SB203580(Invitrogen);p38兔抗小鼠一抗和P-p38兔抗小鼠一抗(Cell signal);羊抗兔二抗(Santa Cruz);Model 680型酶標儀、垂直和轉移電泳槽(Bio-Rad);圖像分析系統(LEICA)。

1.1.2 實驗藥物 淫羊藿苷，分子式為 C33H40O15，分子量676.65，淡黃色結晶，購于中國藥品生物制品檢定所，批號：200414，含量98%(HPLC檢測)。

1.1.3 實驗細胞 小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆14細胞(MC3T3-E1Subclone14)，購于中國科學院細胞庫(ATCC CRL-2594)。

1.2 方法

1.2.1 實驗藥物的制備 取ICA 20 mg，先用少量DMSO溶解，然后再配制成含有不同濃度的培養基，對照組培養基中添加同等濃度的DMSO，實驗各組DMSO的量均小于0.1%。

1.2.2 MC3T3-E1Subclone14細胞培養 MC3T3-E1Subclone14細胞復蘇，置于37℃，5%CO2培養箱培養，細胞分化實驗培養液條件為含有10%碳吸附的胎牛血清(FBS)、20 mmol/L HEPES、50 μg/ml VitC、5 mmol/L β-甘 油 磷 酸 鈉 ( β-GP)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml青霉素的無酚紅的 αMEM 培養基〔7〕，每3 d 換液一次。

1.2.3 WST-8檢測細胞活力 細胞消化后以每孔1×104個接種至96孔板內，細胞貼壁后換無血清無酚紅的αMEM培養液培養24 h，再更換含 ICA(10-7、10-6、10-5mol/L)的培養液或對照液，培養48 h或72 h，每孔加入10 μl的WST-8試劑，置培養箱中孵育1 h后，酶標儀490 nm波長處檢測吸光度(OD)值。

1.2.4 pNPP法檢測細胞 ALP活性 細胞消化后以5×104個/ml的密度每孔3 ml接種到6孔板中，含10%碳吸附FBS的αMEM培養3 d，細胞同步化后更換為含ICA各組培養液或對照液，培養48 h，吸棄培養液，加細胞裂解液1 ml(0.1%Triton X-100)，4℃作用20 min，收集裂解液測定 ALP濃度，以pNPP為底物，據水解磷酯鍵所產生的對硝基酚量測定酶活力。37℃、pH10.0條件下，每分鐘轉化產生1 μmol/L對硝基酚的酶量為1個酶單位。BCA法檢測細胞總蛋白進行蛋白濃度校正，ALP活性以U/μg蛋白表示。阻斷ER信號組將細胞先用含有1 μmol/L ICI182780 的培養液預處理 2 h〔5〕，然后和藥物共培養;阻斷p38信號先用含有20 μmol/L SB203580的培養液預處理 2 h〔6〕，然后和藥物共培養。

1.2.5 ELISA法檢測細胞Col I和BGP 細胞消化后以5×104個/ml的密度每孔3 ml接種到6孔板中，含10%碳吸附的FBS的αMEM培養3 d，細胞同步化后更換為各組含藥培養液或對照液，培養72 h，吸棄孔中的培養液，每孔加含PMSF的細胞裂解液750 μl，冰上裂解20 min。收集裂解液，ELISA法測BGP和ColⅠ，包括標準曲線的繪制，加樣，溫育，洗滌，加底物，溫育，加終止液，酶標儀測OD值，根據標準曲線計算含量，具體步驟按說明書進行。BCA法檢測細胞總蛋白進行蛋白濃度校正。阻斷ER信號組將細胞先用含有1 μmol/L ICI182780的培養液預處理2h，然后和藥物共培養;阻斷p38信號先用含有20 μmol/L SB203580的培養液預處理2h，然后和藥物共培養。

1.2.6 茜素紅染色計數細胞礦化 細胞消化后以5×104個/ml的密度每孔3 ml接種到6孔板中，含10%碳吸附的FBS的無酚紅αMEM培養3 d，細胞同步化后更換為各組含藥培養液或對照液，培養14 d后，吸去培養液，95%乙醇固定20 min，吸去固定液，加入0.1%的茜素紅染色液，30 min，祛除染色液;在低倍鏡視野(4×10)下進行礦化結節計數，每孔細胞隨機計數6個視野的礦化結節數。

1.2.7 Western印跡檢測p38MAPK的表達 細胞消化后以2×107個/瓶接種于25 cm2的培養瓶內，細胞同步化后分組，不同條件干預24 h后，細胞裂解，Western印跡檢測p38MAPK和磷酸化的p38MAPK蛋白的表達。

2 結果

2.1 ICA對 MC3T3-E1 Subclone14細胞活力的影響 10-7、10-6、10-5mol/L的ICA在細胞培養48 h和72 h后，和對照組比較，統計學無顯著性差異(P＞0.05)，見表1。

2.2 ICA對MC3T3-E1 Subclone14細胞分化和礦化的影響和對照組比較，10-7、10-6、10-5mol/L 的 ICA 組 ALP、ColⅠ活性均明顯升高(P＜0.01或P＜0.05);10-6、10-5mol/L的ICA組BGP較對照組明顯升高(P＜0.01);ICA各組細胞形成礦化結節的數量較對照組均明顯升高(P＜0.01)，見表2，圖1。

2.3 阻斷ER信號對MC3T3-E1Subclone14細胞分化的影響ER阻斷劑 ICI182780共同處理后，10-5mol/L的 ICA促進MC3T3-E1 Subclone14細胞表達 ALP、Col I、BGP 明顯減少，和單純應用ICA組有明顯差異(P＜0.01)，見表3。

2.4 ICA對MC3T3-E1細胞p38MAPK蛋白磷酸化的影響不同濃度的ICA培養24 h后，Western印跡檢測結果相對分析表明，ICA可以劑量依賴性的提高p38MAPK蛋白磷酸化的表達量，10-7，10-6，10-5mol/L ICA 組蛋白相對表達量分別為0.050±0.013，0.067 ±0.020，0.096 ±0.019，經單因素方差分析，各劑量組和對照組(0.030±0.016)以及各劑量組之間在統計學上均有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)，見圖2。

表1 ICA對MC3T3-E1 Subclone14細胞活力的影響(s)

表1 ICA對MC3T3-E1 Subclone14細胞活力的影響(s)

48 h 72 h組別 n

表2 ICA對MC3T3-E1 Subclone14細胞分化和礦化的比較( s，n=6)

表2 ICA對MC3T3-E1 Subclone14細胞分化和礦化的比較( s，n=6)

與對照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

組別 ALP(U/mg)Col I(ng/mg)BGP(pg/mg)礦化結節數(n)27 10-7mol/L ICA 18.04±1.491)68 58±14.522) 14.34±2.68 53.50±3.732)10-6mol/L ICA 20.65±1.522)85.76±14.332)17.25±1.622)62.00±4.002)10-5mol/L ICA 53.91±6.082)102.82±11.732)20.29±2.162)72.33±4.632)對照組 15.49±1.75 46.13±10.48 11.98±1.47 43.33±4.

表3 阻斷ER信號對MC3T3-E1Subclone14細胞分化活性的比較( s，n=6)

表3 阻斷ER信號對MC3T3-E1Subclone14細胞分化活性的比較( s，n=6)

與對照組比較：1)P＜0.01;與ICA組比較：2)P＜0.01，下表同

組別 ALP(U/mg)Col I(ng/mg)BGP(pg/mg)15.64±1.73 40.92±8.80 12.18±0.85 ICI182780組 15.91±1.51 39.03±9.59 11.97±1.08 ICA組 34.29±3.311) 88.43±10.591) 19.20±1.581)ICA+ICI182780組16.17±2.622) 48.87±9.662) 12.96±0.512)對照組

2.5 阻斷p38MAPK信號對MC3T3-E1Subclone14細胞分化的影響 與 p38MAPK阻斷劑 SB203580(20 μmol/L)共同處理后，10-5mol/L的 ICA促進 MC3T3-E1Subclone14細胞表達ALP、Col I、BGP明顯減少，和單純應用ICA組有明顯差異(P＜0.01)。見表4。

2.6 p38MAPK活化和ER的關系 加入ER阻斷劑ICI182780后ICA促p38MAPK磷酸化明顯減弱，和10-5mol/L ICA組比較在統計學上有明顯差異(0.036±0.011 vs 0.084±0.012，P＜0.01)，單純加入ICI182780組磷酸化和對照組無明顯差異(0.032±0.013 vs 0.029±0.012，P ＞0.05)，因此可以推定p38MAPK信號可能在ER信號的下游，見圖3。

表4 阻斷p38信號對MC3T3-E1Subclone14細胞分化活性的比較( s，n=6)

表4 阻斷p38信號對MC3T3-E1Subclone14細胞分化活性的比較( s，n=6)

組別 ALP(U/mg)Col I(ng/mg)BGP(pg/mg)15.96±1.23 47.48±8.07 12.40±1.19 SB203580組 15.37±1.17 47.94±9.19 12.00±1.78 ICA組 35.05±2.271) 88.98±7.781) 20.16±2.151)ICA+SB203580組 16.06±2.062) 51.33±7.562) 13.09±1.052)對照組

圖1 細胞培養14 d，各組的礦化結節圖

圖2 ICA對MC3T3-E1細胞p38MAPK蛋白相對表達量的影響

圖3 阻斷ER信號后p38MAPK活化的情況

3 討論

既往研究已經顯示ICA可以影響成骨細胞活性，但具體作用靶點尚不清楚。MC3T3-E1 Subclone 14是從克隆的但是表型各異的MC3T3-E1細胞系中分離出一個亞克隆，和原代培養顱頂OB的行為類似，是研究體外OB分化的較好模型。我們通過研究發現在一定的濃度范圍內(10-7、10-6、10-5mol/L)ICA不影響MC3T3-E1 Subclone 14細胞的增殖，但在促分化的試驗中我們發現ICA可以濃度依賴性的促進細胞ALP、Col I、BGP的表達，促進礦化結節的形成，這和陳克明等〔8〕的研究具有相似之處，它們發現ICA無促進細胞增殖活性，10-5mol/L及更高濃度可抑制骨髓間質干細胞增殖，但10-5mol/L的ICA促進原代培養的骨髓間質干細胞的成骨性分化。

許多補腎中藥都有類性激素樣作用，因此被作為植物雌激素，主要分為異黃酮類、香豆雌酚、木質素類〔9〕。淫羊藿苷屬黃酮類的化合物，因此在進一步的作用機制研究中我們首先選擇了雌激素受體信號。雌激素受體信號是成骨細胞分化過程中的一個重要信號，雌激素通過雌激素受體參與骨骼生理和病理的相關過程，對骨的生長發育、成熟以及骨量維持有重要意義。最初認為雌激素的功能只受核雌激素受體ERα和ERβ的調控，隨著研究的深入，諸多證據表明存在與質膜結合的ER，并通過激活信號通路調控基因表達〔10〕。ICI182780是一種甾體類選擇性雌激素受體調節劑，是ER的特異性拮抗劑，通過加速ER降解而下調ER、影響ER二聚體化、干擾ER細胞核定位以及減少ER與ERE的結合。ERα和ERβ都同樣對特異性拮抗劑ICI182780反應，ICI182780基本可以完全阻斷雌激素的效應。對于ICI182780的用量一般文獻認為終濃度為1 μmol/L時即可完全阻斷雌激素的效應，因此我們在實驗中也采用了終濃度為1 μmol/L的實驗濃度。實驗通過用ICI182780阻斷ER后發現，ICA促進MC3T3-E1細胞分化作用明顯下降，可見ER中介了ICA的促分化的作用，這也和其他一些異黃酮類化合物的作用類似〔5〕。

MAPK通路主要包括細胞外信號調節激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK，又稱SAPK)、p38和ERK5通路等，是胞內信號轉導的重要成員，參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生理過程〔11〕，是多種因素激發胞內信號的會聚點。Suzuki等研究發現在OB的分化過程中，p38對細胞分化起著重要作用，但對增殖的作用不明顯，ERK途徑對細胞的增殖起重要作用，對其分化作用不明顯〔12〕。p38MAPK可以介導一些激素和生長因子刺激OB分化的作用，如甲狀旁腺激素〔13〕、脂聯素等〔14〕。已發現的可以影響骨代謝的一些中藥活性成分均可通過p38MAPK信號來影響 OB 分化，如香豆素〔6〕、金雀異黃酮〔15〕、蛇床子素〔16〕等。因此我們推測ICA也可通過p38MAPK信號影響OB分化。我們研究發現，ICA(10-7、10-6、10-5mol/L)可以劑量依賴性的提高p38MAPK蛋白磷酸化的表達量;應用特異性阻斷劑SB203580處理后，可以顯著降低 ICA促進 MC3T3-E1 Subclone14細胞表達ALP、Col I、BGP的作用。進一步研究發現，雌激素受體阻斷劑ICI182780可以降低ICA促細胞p38MAPK的磷酸化的作用，說明p38MAPK信號在雌激素受體信號的下游。因此我們認為ICA促MC3T3-E1 Subclone14細胞分化的作用主要是通過ER受體信號和p38MAPK信號來實現的。

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