附子對氧自由基及性激素代謝相關基因表達的影響

王世軍 于華蕓 季旭明 吳智春 韓冰冰 (山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

陽虛是引起衰老的主要原因〔1〕，如《素問》云：“陽氣者，若天與日，失其所則折壽而不彰，故天運當以日光明”，治當補火助陽之法。附子為毛莨科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx.)的子根加工品。臨床常取其辛甘大熱之性，補火助陽用治腎陽不足，命門火衰所致陽痿滑精、宮寒不孕以及眩暈耳鳴，須發早白等癥。現代藥理學研究也證實附子有一定的抗氧化、抗衰老作用〔2〕，并能興奮下丘腦-垂體-性腺軸。但尚未有從基因水平研究其發揮“溫陽補火”功效用治陽虛衰老病證機制的相關報道。本項研究應用全基因組基因芯片技術，研究大鼠灌胃附子水煎液后肝組織基因表達譜的變化，為附子溫熱效應及產生機制提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠20只，體重180～200 g，魯抗醫藥集團股份有限公司實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(魯)20080002。

1.2 實驗用藥 附子，水煎濃縮，濃度為0.675 g生藥/ml，4℃儲存備用。

1.3 試劑與儀器 大鼠全基因組表達譜基因芯片，芯片類型：RatRef-12-V1，芯片條形碼編號：4562019003(美國Illumina公司);Unizol試劑和cRNA擴增與標記試劑盒(上海博星基因芯片有限責任公司);DEPC(美國Sigma公司);定量PCR試劑盒(上海吉瑪制藥技術有限公司);微珠芯片掃描儀和微珠芯片分析軟件(美國 Illumina公司);核酸分析儀(美國 Infinigen公司);FR-200型凝膠成像儀(上海復日科技);AB 7900熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.4 實驗分組與給藥方法 實驗動物隨機分為附子組和對照組，每組10只。附子組灌胃附子水煎濃縮液1 ml(含生藥)/100 g，對照組灌胃等容量生理鹽水，1次/d，連續20 d。

1.5 肝組織總RNA提取與質量檢測 給藥結束后處理動物，迅速剝取大鼠肝組織，Unizol試劑提取肝組織總RNA，核酸分析儀定量，1%瓊脂糖凝膠電泳質檢。

1.6 RNA擴增和芯片制作 按照Illumina Total Prep RNA擴增試劑盒操作程序進行RNA擴增。RNA反轉錄合成第1鏈cDNA，合成第2鏈 cDNA，cDNA純化，體外轉錄合成 cRNA，cRNA純化，雜交，洗滌，染色，干燥后進行芯片掃描。

1.7 基因芯片數據處理與分析 應用微珠芯片掃描儀掃描芯片，應用微珠芯片圖像分析軟件對芯片灰度掃描圖進行分析處理。應用立方樣條函數(Cubic Spline)方法對原始數據歸一化處理。差異基因的篩選標準為附子組與對照組為有效基因，且實驗組差異分值(Diffscore值)＜-20或者大于＞+20。利用Agilent Genespring GX 11分析軟件對差異基因按照Gene Ontology(GO)分類標準進行基因功能分類注釋，Log10P值＜-1.3的基因功能為顯著性基因功能。

1.8 實時熒光定量PCR驗證 選取附子組與對照組比較差異表達的基因 Gclc為目的基因，β-actin為管家基因，采用SYBR GreenⅠ法進行實時熒光定量PCR檢測以驗證芯片數據的可靠性。引物由primer-5.0設計，基因Gclc的引物序列：上游：ACCTCTGCTGAGAACAGTCGTC，下游：ATCTGGAATGAAATGAATGGCT。實時PCR分析由AB 7900熒光定量PCR儀完成。每個樣本重復測定3次。

2 結果

2.1 總RNA抽提結果 兩組總RNA的Ratio比值(OD260nm/OD280nm)均在2.0左右，電泳檢查有清晰的RNA條帶，28 S和18 S比值在2∶1以上，符合基因芯片質量檢測要求。見圖1。

圖1 各組RNA的電泳圖

2.2 基因芯片Cy3熒光掃描圖像 見圖2。

2.3 基因表達譜結果與生物信息學分析 附子組與對照組比較有592條基因差異表達，應用Agilent Genespring GX 11分析軟件對差異基因進行基因功能顯著性分析，催化活性基因功能為較顯著性基因功能(Log10P值為-11.534 6)，42條差異基因與氧化還原酶活性相關(上調26條，下調16條)，其中7條與氧自由基的生成和清除相關，3條涉及性激素代謝。見表1。

圖2 各組芯片熒光掃描圖

表1 附子組與對照組比較部分差異表達基因列表

2.4 實時熒光定量PCR驗證 Gclc基因在附子組與對照組2-△△Ct數值比是2.120 4，說明附子可以上調Gclc基因表達，與芯片結果一致。

3 討論

附子可顯著增強老齡大鼠抗氧化酶活性，降低自由基代謝產物含量，起到延緩衰老的作用〔2〕;所含附子多糖能夠清除運動過程中產生的自由基，具有一定的抗氧化作用〔3〕。提示抗氧化、抗衰老可能是附子發揮溫熱效應的途徑之一。

超氧陰離子是活性氧自由基的重要代表。NADPH氧化酶是機體內超氧陰離子生成的重要催化酶〔4，5〕，由膜亞基細胞色素b558(p22phox和 gp91phox蛋白)、多個細胞質亞基(p47phox、p67phox和 p40phox蛋白)和小 G 蛋白 Rac-1 組成〔6，7〕，其中 p22phox和p47phox分子分別由Cyba(NM_024160)和Ncf1(NM_053734)基因編碼。研究結果顯示，附子組Cyba和Ncf1表達下調，提示附子可能通過下調Cyba和Ncf1表達水平，導致NADPH氧化酶水平或活性降低，減少超氧陰離子的生成〔8〕。

研究發現，與自由基清除有關的 Gpx1、Gsr、Gclc、Dhcr2等基因表達上調。谷胱甘肽(GSH)是細胞內重要的水溶性抗氧化劑，是羥自由基、H2O2和單線態氧的清除劑。谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)是生物體內GSH合成的限速酶。Gclc(NM_012815)編碼其催化亞單位，含有GCL所有底物的結合位點和所有的催化亞基，具有全酶活性〔9〕，其表達上調可增加GSH合成。Gpx1(NM_030826)和Gsr(NM_053906)則分別編碼谷胱甘肽過氧化物酶-1(GPx-1)和谷胱甘肽還原酶(GSR)。GPx-1是生物機體內重要的抗氧化酶之一，利用谷胱甘肽作為還原劑，將生物體內的H2O2或脂質過氧化物轉變為H2O或較穩定的脂類烴基化合物，從而阻斷活性氧對機體的損傷。GSR利用NADPH+H+作為供氫體，將上述反應生成的氧化型的谷胱甘肽(GSSG)轉變為 GSH，以保證生理條件下細胞內 GSH和GSSG的高比值〔10〕。Dhcr24(XM_216452)編碼的24-脫氫膽固醇還原酶也被證實具有清除H2O2，抗氧化作用〔11〕。

此外，研究結果顯示，附子可調控性激素代謝相關基因的表達，上調雄激素代謝相關Srd5a1、Cyp3a18基因表達，下調性激素滅活相關基因Hsd17b2表達。Srd5a1(NM_017070)編碼類固醇-5α-還原酶-1，能催化睪酮轉化為生物活性不盡相同的另一種雄激素二氫睪酮;Cyp3a18(NM_145782)編碼CYP3A18蛋白，具有睪酮羥化酶活性，在雄激素代謝中發揮重要作用。Hsd17b2(NM_024391)編碼的17β-羥類固醇脫氫酶-2可催化雄激素和雌激素轉變為低活性的形式，參與雌二醇、睪酮和DHT的滅活和排泄過程〔12〕。附子調控參與性激素代謝的氧化還原酶基因表達，可促進性激素轉化，減少其滅活和排泄。

由上可知，附子可調控氧自由基代謝相關基因的表達，即下調超氧陰離子生成催化酶基因水平，上調自由基清除相關基因表達水平，而減少自由基的生成，促進自由基的清除，發揮抗氧化作用;調控與性激素代謝相關的基因表達以促進性激素轉化，減少性激素滅活，發揮一定抗氧化、抗衰老作用，這可能是附子“助陽補火”臨床用治陽虛衰老的重要途徑，也是其溫熱效應發揮的分子機制之一。

1 吳中朝，王玲玲，徐蘭風.試論老年人陽虛挾瘀衰老本質〔J〕.江蘇中醫，1994;21(2)：135-7.

2 張 濤，王桂杰，白書閣.附子對老年大鼠抗氧化系統影響的實驗研究〔J〕. 中國老年學雜志，2001;21(2)：135-7.

3 劉古鋒，吳偉康，段新芬，等.附子多糖對力竭運動小鼠自由基代謝的影響〔J〕.陜西醫學雜志，2008;37(5)：529-31.

4 Cai H，Griendling KK，Harrison DG.The vascular NAD(P)H oxidase as therapeutic targets in cardiovascular diseases〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2003;24(9)：471-8.

5 Bayraktutan U，Blayney L，Shah AM.Molecular characterization and localization of the NAD(P)H oxidase components gp91-phox and p22-phox in endothelial cells〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2000;20(8)：1903-11.

6 Babior BM.NADPH oxidase〔J〕.Curr Opin Immunol，2004;16(1)：42-7.

7 Kim MJ，Shin KS，Chung YB，et al.Immunohistochemical study of p47Phox and gp91Phox distributions in rat brain〔J〕.Brain Res，2005;1040(1-2)：178-86.

8 Ambasta RK，Kumar P，Griendling KK，et al.Direct interaction of the novel Nox proteins with p22phox is required for the formation of a functionally active NADPH oxidase〔J〕.J Biol Chem，2004;279(44)：45935-41.

9 羅伶俐，鄒國民，李 冰，等.人γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位基因E-box元件功能初步分析〔J〕.中國病理生理雜志，2008;24(7)：1428-30.

10 王 浩.生物化學〔M〕.北京：人民衛生出版社，2002：404.

11 蘆秀麗，劉劍利，曹向宇，等.24-脫氫膽固醇還原酶抗氧化應激作用的功能結構域鑒定〔J〕.中國生物工程雜志，2009;29(5)：50-4.

12 張萬飛.人類17β-羥類固醇脫氫酶的功能〔J〕.海南醫學，2008;19(1)：127-30.