自噬抑制劑3-MA對乳胞素抑制胃癌BGC-823細胞增殖的影響及其機制

金鎮勛 蘭汝春 王 菲 董長松 徐 冶 (吉林醫藥學院附屬醫院消化科，吉林 吉林 3203)

細胞內存在兩種主要的蛋白質降解途徑，泛素-蛋白酶體途徑和自噬途徑，自噬途徑主要降解長壽命蛋白，而泛素-蛋白酶體途徑則主要降解短壽命蛋白，這些蛋白包括一些細胞周期蛋白、轉錄因子、抗腫瘤蛋白和促凋亡蛋白。蛋白酶體廣泛存在于真核細胞中，泛素-蛋白酶體系統是生物體內進行蛋白質選擇性降解的重要途徑之一，泛素-蛋白酶體系統的異常可以導致多種疾病的發生，其中在腫瘤發展中的作用越來越受到人們的重視。乳胞素(Lactacystin，LAC)是鏈霉菌屬的代謝產物，可以通過細胞膜，引起不可逆的蛋白酶體抑制〔1〕，被廣泛應用于蛋白酶體的研究中〔2～4〕。本研究通過體外培養BGC-823，觀察自噬抑制劑3-MA對蛋白酶體抑制劑LAC抑制BGC-823細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 噻唑藍(MTT)購自美國Sigma公司;胎牛血清(BSA)、IMEM培養基購自美國Gibco公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺、N，N-二甲基雙丙烯酰胺、過氧化物酶標記二抗購自北京鼎國生物技術有限公司;β-肌動蛋白(β-actin)、細胞色素 C(Cytochrome C)、半胱氨酸蛋白酶-4(caspase-4)抗體購自美國SANTA CRUZ公司。

1.2 實驗分組 分為對照組、3-MA 5 mmol/L組、LAC 5 μmol/L組和 LAC 5 μmol/L+3-MA 5 mmol/L 組。

1.3 MTT法檢測細胞存活率 取處于對數生長期的BGC-823細胞，胰酶消化后800 r/min離心，按每孔含1×104BGC-823細胞加入96孔細胞培養板，37℃，5%CO2培養箱中培養過夜使BGC-823細胞完全貼壁。設立對照組以及不同濃度LAC組，每個LAC濃度9個重復孔，LAC作用12 h后每孔加入20 μl MTT，CO2培養箱中繼續孵育4 h，吸掉96孔板中的培養液，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩器振蕩10 min。BIO-TEK酶標儀上，選擇490 nm波長，測定每孔中吸收值，計算細胞增殖率。對照組細胞存活率為100%，加藥各組存活率=(各濃度組A值/對照組A值)×100%。

1.4 Western印跡法檢測各組細胞 β-actin、Cytochrome C、caspase-4蛋白表達水平 (1)蛋白的提取：處于對數生長期的BGC-823細胞，待細胞生長到培養瓶70%時，隨即將4瓶細胞分為4組，作用12 h后，胰酶消化離心，每瓶加入120 μl預先冷卻的細胞裂解液(RIPA)，混勻，細胞粉碎儀超聲粉碎2次，每次5 s，4℃作用60 min，3 000 r/min離心收集上清。(2)蛋白濃度測定：根據說明書，利用BSA測定各組蛋白濃度。(3)蛋白質的變性：每管加入30 μl 5×上樣緩沖液，煮沸變性。(4)丙烯酰胺凝膠電泳：將每組蛋白緩慢加入加樣孔中，加入電泳液，濃縮膠80 V，25 min;分離膠160 V，45 min。電泳結束后，根據目的蛋白分子量的不同剪切分離膠。轉膜，首先放置1層海綿2層濾紙，然后放入分離膠，聚偏氟乙烯(PVDF)膜，最后上面再放置2層濾紙和1層海綿，放入冰盒，倒入足夠的轉膜液，100 V，55 min。轉膜結束后取出PVDF膜，放入5%脫脂奶粉封閉2 h。封閉結束后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗膜3次，每次5 min，然后加入相應一抗 (β-actin、Cytochrome C、caspase-4;1∶200稀釋)，4℃冰箱過夜，次日回收一抗，PBS洗膜3次，時間分別為1×15 min、2×5 min，加入過氧化物酶標記的相應二抗(1∶1 000稀釋)搖床搖2 h，二氮基聯苯胺(DAB)顯色。

1.5 統計學分析 采用SPSS12.0統計學軟件，各組之間各項檢測指標比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 單獨應用LAC以及聯合應用3-MA對各組胃癌BGC-823細胞增殖率的影響 MTT結果顯示，與Control組(100%)相比，LAC 5 μmol/L可以引起細胞增殖下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)。同時聯合應用 LAC 5 μmol/L和 3-MA 5 mmol/L可以進一步引起細胞增殖率的下降，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 各組BGC-823細胞Cytochrome C表達水平 單獨應用蛋白酶體抑制劑LAC可以引起線粒體凋亡相關蛋白Cytochrome C表達水平升高，而聯合應用LAC和3-MA時，Cytochrome C表達水平進一步升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。提示3-MA可以增加LAC引起的線粒體凋亡。見圖1。

2.3 各組BGC-823細胞caspase-4表達水平 單獨應用蛋白酶體抑制劑LAC可以引起caspase-4表達水平的升高，而聯合應用LAC和3-MA時，caspase-4表達水平進一步升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。提示3-MA可以增加LAC引起的內質網介導的凋亡。見圖2。

圖1 各組BGC-823細胞Cytochrome C蛋白表達比較

圖2 各組BGC-823細胞caspase-4蛋白表達比較

3 討論

蛋白質的新陳代謝對于維持正常的細胞功能，促進細胞存活極其重要。泛素-蛋白酶體途徑在降解陳舊蛋白質從而促進蛋白質的新陳代謝中發揮重要的作用。細胞內蛋白質降解必須由精確的時間和空間來調節。泛素-蛋白酶體途徑由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)、泛素-蛋白連接酶(E3)、26S蛋白酶體和泛素解離酶(DUBs)等組成。泛素蛋白酶體對蛋白質的降解是一個連續的過程〔5〕。E1首先催化泛素使其C-末端甘氨酸殘基與E1的半胱氨酸殘基間形成高能硫酯鍵而活化。活化的E1-泛素結合的中間體再將泛素轉移給泛素結合酶E2，從而形成E2-泛素中間體。最后一步，泛素-蛋白連接酶E3與靶蛋白結合，促使泛素分子相繼連接到靶蛋白上，形成一條多泛素鏈〔6〕。如果蛋白質降解出現了異常，將會導致嚴重的細胞生長障礙，包括增殖和分化的障礙，同時，泛素蛋白酶體的異常還可以誘導多種疾病的發生。蛋白酶體抑制劑LAC通過阻止細胞內20 S蛋白酶體與蛋白起接觸反應的β亞單位，從而有效專一抑制 20S蛋白酶體活性〔7～9〕。

本研究通過體外培養胃癌BGC-823細胞，利用蛋白酶體抑制劑LAC可以明顯地引起BGC-823細胞增殖率的下降，聯合應用自噬抑制劑3-MA可以增加LAC引起的細胞增殖率的下降。本文進一步利用Western印跡方法檢測了線粒體凋亡相關蛋白Cytochrome C以及內質網凋亡相關蛋白caspase-4變化，LAC可以引起線粒體凋亡相關蛋白Cytochrome C以及內質網凋亡相關蛋白caspase-4表達水平升高，當聯合應用自噬抑制劑3-MA時，可以進一步引起Cytochrome C和caspase-4升高，提示3-MA可以增加LAC引起的細胞凋亡。以上結果表明，同時抑制蛋白酶體降解途徑和自噬降解途徑，能更加有效地抑制BGC-823細胞增殖，這一機制為胃癌治療提供了新的思路。

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7 Mukhopadhyay D，Riezman H.Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling〔J〕.Science，2007;315(5809)：201-5.

8 Hao B，Zheng N，Schulman BA，et al.Structural basis of the Cks1-dependent recognition of p27(Kip1)by the SCF(Skp2)ubiquitin ligase〔J〕.Mol Cell，2005;20(1)：9-19.

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