阿托伐他汀通過ERK1/2通路抑制內皮微粒誘導的人臍靜脈內皮細胞ICAM-1的表達

陸永光 符春暉 嚴 華 黃軍章 (欽州市第二人民醫院心內科，廣西 欽州 535000)

血管內皮結構完整性破壞和功能障礙是心血管疾病發生和發展的早期的重要事件。近年來研究證實，內皮細胞在各種刺激因素作用下激活和凋亡的過程中，可釋放出內皮細胞微粒(EMPs)。EMPs不但可作為評價心血管疾病狀態下內皮功能的指標，而且還具有生物學活性，可以作為生物信使分子參與介導血管炎癥、血栓形成、血管生成等生物學過程〔1〕。阿托伐他汀具有獨立于降脂之外的抑制內皮炎癥、保護內皮細胞，延緩動脈粥樣硬化進展的作用〔2〕。但阿托伐他汀對EMPs誘導的內皮細胞功能的影響及其機制尚不清楚。研究表明，細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)信號通路的激活與內皮炎癥反應存在著密切的關系〔3〕。本研究主要探討阿托伐他汀對EMPs誘導HUVECs細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達的影響及與ERKl/2信號轉導通路的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人臍靜脈內皮細胞系ECV-304(美國ATCC公司)。RPMI-1640培養基、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶(美國Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);TNF-α(英國PeProtech公司);異氰酸熒光素(FITC)標記的CD42單克隆抗體、藻紅蛋白(PE)標記的CD31單克隆抗體(美國Proteintech Group公司);0.8 μm、3.0 μm 標準微粒(美國 Duke公司);阿托伐他汀(美國輝瑞公司);Trizol(美國Invitrogene公司);ERK1/2抑制劑PD98059(德國Calbiochem公司);PCR引物(上海生物工程有限公司);First-Strand cDNA Synthesis試劑盒、All-in-OneTM qPCR Mix(美國GeneCopoeia公司);鼠抗人ICAM-1抗體、鼠抗人β-actin抗體(美國Biolegend公司);鼠抗人磷酸化ERK1/2抗體、鼠抗人總ERK1/2抗體(美國Cell Signaling公司);辣根過氧化酶(HRP)標記羊抗鼠IgG(北京中山生物技術公司);增強化學發光試劑(美國Pierce公司)。

1.2 主要儀器 SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司);水套式二氧化碳培養箱(美國SHELLAB公司);Epics XL型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司);CKX-41型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);FLX-800熒光酶標儀(美國Bio-Tek公司);T personal PCR儀(德國 Biometra公司);ABI Prism 7500型熒光定量基因擴增儀(美國ABI公司);Gel-Doc2000型凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司);垂直電泳儀、電泳槽、蛋白電泳轉膜裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HUVECs的培養和分組 將HUVECs細胞株ECV-304解凍復蘇后，加入含10%小牛血清的1640培養基，于37℃、5%CO2的培養箱中培養，隔天換液，進行傳代。將4～5代生長良好的細胞，用含10%血清1640培養基調成1×105/ml，接種于24孔板中，待細胞接近80%融合時換不含血清的培養基，繼續培養24 h使細胞同步后進行干預。按實驗設計分為EMPs不同劑量干預組，用不同濃度(0、102、103、104、105/ml)EMPs 作用HUVECs 24 h;阿托伐他汀作用組，在加入EMPs前用不同濃度的阿托伐他汀(0、0.1、1、10 μmol/L)和終濃度為10 μmol/L的PD98059作用于HUVECs 1 h。每組6個復孔。

1.3.2 EMPs的制備 參照既往研究的方法用TNF-α刺激HUVECs制備 EMPs〔4〕。在 37℃ 下，用終濃度為 100 ng/ml的TNF-α與HUVECs孵育48 h，刺激 HUVECs產生 EMPs。將培養基上清離心5 min，去除細胞及細胞碎片，然后再在10℃下離心2 h。用 PBS洗滌沉淀2次，以去除 TNF-α，用 PBS重懸EMPs。取100 μl分成兩管，一管加入 FITC-CD42單抗和 PECD31單抗各10 μl，另一管加入等量對照抗體，在室溫下孵育15 min，洗滌2次后，加入100 μl PBS液后即上流式細胞儀檢測。用0.8 μm標準微粒設門，3 μm標準微粒對EMPs進行定量。樣本在上流式細胞儀檢測前分別加入105個0.8 μm和3 μm標準微粒，測定直徑0.8～3 μm的細胞膜微粒，當收集到2×104個3 μm標準微粒后即停止計數，并作為參照標準計算出EMPs的濃度。EMPs定義為直徑小于1.0 μm且 CD31+/CD42-陽性的微粒。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測ICAM-1 mRNA的表達 收集細胞后，用Trizol一步法提取RNA。按試劑盒的說明配制25 μl反應體系，在37℃反應60 min，85℃滅活處理5 min，將mRNA逆轉錄cDNA。引物序列設計如下：ICAM-1上游引物：5'-CCGGAAGGTGTATGAACTG-3'， 下 游 引 物：5'-TCCATGGTGATCTCTCCTC-3';β-actin 上游引物：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。反應條件為：95℃預變性10 min，然后進行40個循環，包括95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸31 s。反應結束后記錄擴增曲線和熔解曲線。根據2-ΔΔCt法分析ICAM-1的相對表達量，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組。

1.3.4 蛋白免疫印跡檢測ICAM-1蛋白表達及ERK1/2磷酸化水平 收集各組HUVECs細胞，加入預冷的含蛋白酶抑制劑細胞裂解液，提取細胞總蛋白，用Bradford法測定蛋白的濃度。各組分別取蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。分離后的蛋白用電印法電轉移到硝酸纖維膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，分別加入 ICAM-1(1∶300)、p-ERK(1∶300)和 β-actin(1∶300)一抗，4℃過夜。漂洗后加對應辣根過氧化物酶的二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h。增強化學發光法進行顯色，凝膠成像系統照相，采用Quantity One軟件進行圖像灰度分析。

1.4 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件對數據進行統計學分析。計量數據以s表示，多組間比較方差不齊，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗。

2 結果

2.1 EMPs對ICAM-1 mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2表達的影響 從103個/ml開始，隨著EMPs濃度的增加，ICAM-1 mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2的表達逐漸增加(均P＜0.01)。見表1和圖1。

2.2 阿托伐他汀對ICAM-1 mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2表達的影響 105/ml濃度的 EMPs作用 HUVECs 12 h后，ICAM-1 mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2的表達明顯增加(P＜0.01)，而阿托伐他汀及ERK1/2抑制劑PD98059則可明顯抑制ICAM-1 mRNA和蛋白的表達及ERK1/2的磷酸化(均P＜0.01)。見表2和圖2。

表1 不同濃度EMPs作用HUVECs后ICAM-1 mRNA及蛋白的表達( s，n=6)

表1 不同濃度EMPs作用HUVECs后ICAM-1 mRNA及蛋白的表達( s，n=6)

與空白對照及102/ml比較：1)P＜0.01;與103/ml比較：2)P＜0.01;與104/ml比較：3)P ＜0.01

EMPs濃度(個/ml)ICAM-1 mRNA ICAM-1蛋白(%)0＜0.01 ＜0.01 1.02±0.03 21.6±2.7 102 1.11±0.06 23.3±3.5 103 1.35±0.101) 40.8±6.01)104 1.83±0.161)2) 50.4±7.11)2)105 2.43±0.191)2)3) 69.9±8.21)2)3)H值 11.269 7.953 P值

圖1 不同濃度EMPs作用HUVEC后磷酸化ERK1/2的表達

表2 阿托伐他汀對ICAM-1 mRNA及蛋白表達的影響( s，n=6)

表2 阿托伐他汀對ICAM-1 mRNA及蛋白表達的影響( s，n=6)

與空白對照組比較：1)P＜0.01;與 EMPs組比較：2)P＜0.01;與EMPs+阿托伐他汀0.1 μmol/L組比較：3)P＜0.01;與EMPs+阿托伐他汀1 μmol/L 組比較：4)P ＜0.01

組別 ICAM-1 mRNA ICAM-1蛋白(%)空白對照組＜0.01 ＜0.01 1.02±0.03 22.1±2.3 EMPs組 2.48±0.161) 71.2±9.31)EMPs+阿托伐他汀0.1 μmol/L組 2.23±0.152) 58.1±7.22)EMPs+阿托伐他汀1 μmol/L組 1.80±0.143) 44.5±6.83)EMPs+阿托伐他汀10 μmol/L組 1.53±0.114) 31.7±4.74)PD98059組 1.51±0.121) 33.6±5.01)H值 8.542 9.853 P值

圖2 阿托伐他汀對磷酸化ERK1/2表達的影響

3 討論

內皮細胞細胞分泌和釋放的活性物質具有抗凝、抑制炎癥、調節血管張力等作用。研究表明，炎癥介質、細胞因子以及促栓、促凋亡和氧化物質等均可導致內皮細胞的激活、損傷和凋亡，刺激內皮細胞釋放EMPs〔5〕。正常健康者循環血中也可有EMPs的存在，在病理狀態下，特別是以內皮損傷功能障礙為主要特征疾病，EMPs可明顯增高。研究表明，急性冠脈綜合征患者循環血EMPs明顯高于健康對照者和穩定性心絞痛患者〔6〕，EMPs的數量與冠狀動脈粥樣硬化斑塊大小和嚴重程度呈顯著正相關〔7〕。此外，在高血壓、糖尿病、血栓性疾病中也可發現EMPs的明顯增高〔8〕。因此，EMPs可作為反映心血管疾病內皮功能狀態和嚴重程度的指標。本研究通過用TNF-α可刺激HUVECs生成大量的EMPs，表明在一些疾病狀態下，TNF-α等炎性細胞因子增高可能在EMPs的生成中具有重要的作用。

更為重要的是，EMPs從內皮細胞釋放的過程中，攜帶了大量的生物活性物質如內皮蛋白如血管內皮鈣黏著蛋白、血小板內皮細胞黏附分子-1、內皮膜糖蛋白、P-選擇素、細胞黏附分子CD146、整合素αV等〔1〕。因此，EMPs還可以作為生物信使分子參與介導血管炎癥、血栓形成、血管生成等生物學過程。EMPs不但是內皮功能障礙的標志物，更可能是導致內皮功能障礙的重要因素。本研究證實，與EMPs共孵育后，HUVECs表達ICAM-1呈劑量依賴性的增高。而ICAM-1等黏附分子，在單核/巨噬細胞、T淋巴細胞等接觸并黏附到損傷部位的血管內皮，進入動脈壁內膜下間隙的過程中起重要的作用，參與了動脈粥樣硬化斑塊的發生和發展。近年來研究表明，內皮細胞分泌的ICAM-1等黏附分子還通過介導各種炎性細胞的趨化和聚集，參與了缺血再灌注和冠心病介入治療術后心肌損傷的過程〔9，10〕。因此，EMPs可能通過誘導內皮細胞炎癥反應，參與了動脈粥樣硬化斑塊的發生和發展和心肌損傷的過程。EMPs不僅是內皮功能障礙的標志物，也是動脈粥樣硬化和心肌損傷防治的潛在靶分子。

ERK1/2信號轉導通路的激活與內皮炎癥反應存在著密切的關系。研究表明，ERK1/2信號轉導通路參與了HUVECs表達ICAM-1的調控〔11〕。本研究顯示，EMPs可誘導ICAM-1和磷酸化ERK1/2表達的明顯增高，而 ERK1/2特異性抑制劑PD98059可明顯抑制EMPs誘導的ERK1/2磷酸化和ICAM-1的表達。表明EMPs誘導HUVECs表達ICAM-1與激活ERK1/2信號轉導通路有關。大量的研究表明，阿托伐他汀除了具有調脂作用外，還具有抑制炎癥，保護內皮細胞，延緩動脈粥樣硬化發展，穩定斑塊，防治心肌損傷的作用〔2〕。本研究證實，阿托伐他汀可以明顯抑制EMPs誘導HUVECs ICAM-1的表達，且呈劑量依賴性。阿托伐他汀的作用主要通過抑制ERK1/2信號轉導通路的激活實現。因此，阿托伐他汀可明顯抑制EMPs誘導的內皮細胞激活和炎癥反應。

綜述所述，EMPs通過激活ERK1/2信號轉導通路誘導HUVECs表達ICAM-1。阿托伐他汀抑制內皮炎癥，抗動脈粥樣硬化及心肌保護作用可能部分與抑制EMPs的作用有關，EMPs是內皮保護的新的靶分子。

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