血清糖皮質激素調節蛋白激酶3過表達對乳腺癌細胞凋亡的影響

郭紅艷 孫曉杰 劉秀財 樊 麗 于英君

(齊齊哈爾醫學院生物化學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

近幾年的研究表明，血清糖皮質激素調節蛋白激酶(SGK3)可能是多種細胞信號轉導通路和細胞磷酸化級聯反應的一個功能性交匯點，可被應激因素誘導激活，在調節離子通道、細胞增殖、細胞存活和凋亡的信號轉導中起重要的作用〔1〕。目前已發現哺乳類SGK的異構酶有SGK1、SGK2和SGK3(也稱CISK)三種，迄今為止，研究較多的是SGK1，其對鼠的毛囊形態發生、自身穩定以及腸道營養物質的吸收等具有重要作用〔2，3〕。而關于SGK3的研究國內尚未見報道，國外的報道也較少，有文獻報道SGK3可能參與了細胞內磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和Wnt信號通路〔4〕，但其在人類細胞中的生物學功能至今尚未闡明。最新研究顯示，CISK/SGK3對白細胞介素-3(IL-3)撤退所誘導的乳腺癌細胞凋亡具有保護作用〔5〕。在此基礎上，本文將研究CISK/SGK3與乳腺癌細胞凋亡發生發展的相關性及其相關機制，初步闡明CISK/SGK3的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和質粒 乳腺癌細胞MCF7由中國醫學科學院腫瘤研究所提供，細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液在37℃、5%CO2條件下培養。本研究所用pAcG-4T3-SKG3質粒由美國霍普金斯大學醫學院夏獻民博士惠贈，pAcG-4T3-SKG3質粒含有人SGK3 cDNA基因，全長為1.3 kb，含BamH I和Xho I酶切位點。

1.1.2 主要試劑和抗體 RPMI1640、G418購自Gibco BRL公司;細胞培養瓶、培養板購自英國Nunc公司;BamH I和Xho I購自寶生物工程有限公司;biozol、RT-PCR試劑盒購自杭州博日科技有限公司;凋亡檢測試劑盒購自嘉美生物科技有限公司;SGK3多克隆抗體購自 CST公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購自康為世紀科技有限公司;增強化學發光法(ECL)化學發光試劑購自普利萊基因技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pEGFP-N1-SGK3重組質粒的構建 根據SGK3的全長cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，并分別在上游引物和下游引物前加上限制性內切酶XhoⅠ和BamH I識別序列及接頭，通過PCR方法從pAcG-4T3-SKG3質粒中擴增SGK3基因。上游引物序列為5'CCGCTCGAGACCATGGCCCTGAAGATTC 3'，下游引物序列為5'CGC GGA TCC AAA AAT AAG TCT TCT G 3'。純化后的PCR產物經限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后與同樣酶切的載體pEGFP-N1連接構建成重組質粒pEGFP-N1-SGK3。陽性菌株送至上海Invitrogen公司進行測序，測序結果與Genbank源基因用網絡軟件ClustalW進行基因比對，同時提取質粒，對重組質粒進行酶切鑒定。

1.2.2 基因轉染 采用GenEscortTMⅠ 進行細胞轉染，生長良好的乳腺癌細胞株(MCF7)于轉染前24 h接種到6孔板中，待細胞總面積達到60% ～80%，取3 μg pEGFP-N1-SGK3質粒和空載體pEGFP-N1質粒分別進行基因轉染(具體操作按說明書進行)，用G418篩選獲得陽性轉染細胞，建立穩定轉染的細胞系，轉染細胞通過蛋白質印跡法鑒定。

1.2.3 細胞增殖實驗 采用四甲基唑藍(MTT)法繪制細胞生長曲線，取對數生長期的各組細胞，用0.25%胰酶消化后計數，按每孔5×102細胞數接種于96孔培養板，每組設4個平行孔，于37℃、5%CO2孵箱中培養，每天取出一塊培養板，加5 g/L的MTT 20 μl于各孔中繼續培養4 h后棄培養液，各孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，于微量振蕩器振蕩15 min后用酶標儀測定波長570 nm的吸光度值，取4個孔的平均值，以時間為橫坐標，A570值為縱坐標作圖，觀察細胞的增殖情況。

1.2.4 細胞凋亡檢測 細胞培養48 h，常規消化處理各組細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，按細胞凋亡雙染色試驗(Annexin V-FITC/PI)試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡，資料經ModFitL T軟件分析。

1.2.5 凋亡相關基因表達檢測 取對數生長期細胞培養48 h后，用Biozol試劑提取各組細胞總RNA，用RT-PCR試劑盒進行逆轉錄合成cDNA并進行半定量逆轉錄PCR(RI-PCR)，利用Primer Premier 5.0軟件設計bad、bcl-xl及內參β-肌動蛋白(βactin)引物，引物由生工生物工程(上海)有限責任公司合成，引物序列及擴增片段大小如下：β-actin：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'，擴增產物長 263 bp;bad：5'-CCATCCCTTCGTCGTCCTC-3';5'-GCTCCGGCAAGCATCATC-3'，擴增產物長度 162 bp;bcl-xl：5'-CGGGCATTCAGTGACCTGAC-3'， 5'-TCAGGAACCAGCGGTTGAAG-3'，擴增產物長度151 bp。PCR反應條件：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，退火30 s(bad和 bcl-xl的退火溫度分別為51℃、52.3℃)，72℃ 延伸 60 s，循環 30 次，最后 72℃ 延伸10 min，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，AlphaImager圖像分析系統拍照、結果分析。

2 結果

2.1 重組質粒pEGFP-N1-SGK3的鑒定 重組質粒pEGFPN1-SGK3經XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果表明所獲SGK3酶切片段的大小與預期相符，經DNA測序結果表明，所獲克隆序列與理論序列一致。見圖1。

圖1 重組質粒pEGFP-N1-SGK3酶切電泳圖

2.2 轉染細胞中SGK3蛋白表達的鑒定 重組質粒pEGFPN1-SGK3和空載體質粒pEGFP-N1分別轉染MCF7后，經G418篩選得到穩定轉染的細胞系。用抗SGK3抗體通過Western印跡方法檢測發現，SGK3在轉染細胞中能夠有效地表達，而親本細胞和轉染空載體的細胞中未檢測到內源性SGK3的表達。見圖2。

圖2 Western印跡檢測SGK3蛋白在MCF7轉染細胞系中的表達

2.3 SGK3促進腫瘤細胞的生長 為了研究SGK3的過表達對細胞增殖的影響，通過MTT法繪制了各組轉染細胞的生長曲線，與親本細胞及轉染空載體組細胞相比，轉染SGK3的細胞生長速度明顯增快。見圖3。

2.4 SGK3抑制腫瘤細胞的凋亡 各組細胞經流式細胞儀檢測，在雙變量的FCM散點圖上，MCF-7親本細胞凋亡率為：第二象限(0.1%)+第四象限(8.9%)=9.0%，轉染空載體質粒pEGFP-N1細胞組凋亡率為：第二象限(1.4%)+第四象限(8.6%)=10.0%;轉染重組質粒pEGFP-N1-SGK3細胞組凋亡率為：第二象限(1.2%)+第四象限(4.4%)=5.6%。可見，SGK3過表達可明顯抑制乳腺癌MCF7細胞凋亡。見圖4。

圖3 外源性SGK3的過表達對MCF7細胞增殖的影響

圖4 流式細胞術檢測MCF7細胞凋亡的散點圖

2.5 RT-PCR結果 與MCF7親本細胞比較，轉染空載體質粒pEGFP-N1細胞的bad和bcl-xl表達無明顯變化;與以上兩組比較，SGK3過表達可致 MCF7細胞 bad mRNA表達降低和bcl-xl mRNA表達升高。見圖5。

圖5 各組細胞bcl-xl、bad mRNA表達

3 討論

SGK是1993年發現的一個與蛋白激酶B(PKB)第二信使蛋白具有極高同源性的Ser/Thr蛋白激酶，該基因全長2.4 kb，序列高度保守，在各種哺乳動物組織和細胞系中均有表達〔6〕。SGK是一個由多個成員組成的基因家族，其中與SGK(即SGK1)同源程度最高的是SGK2和SGK3，他們的催化結構域具有高達80%的氨基酸序列相同，但很多方面具有顯著的不同之處〔7～9〕。在對SGK3功能的研究中發現，SGK3定位于細胞的內體(endosome)，作為PI3K的下游分子，SGK3也能磷酸化Akt的一些底物如 Forkhead 家族成員轉錄因子(FKHRL1)〔10，11〕;另外，研究發現SGK3與情景記憶和恐怖記憶關系更密切，主要通過促進谷氨酸受體1(GLUR1)的表達增強記憶〔12〕。雖然已有證據顯示，SGK3在某些腫瘤的形成過程中可能擔任著重要的角色，也有報道指出，SGK3對由于IL-3撤退所誘導的乳腺癌細胞MCF7凋亡具有保護作用;但迄今為止，有關SGK3在腫瘤發生發展中的作用及其機制卻未見報道。

本實驗中，為了研究外源SGK3基因生物學功能，首先構建了重組質粒pEGFP-N1-SGK3，進而將該質粒和空載體質粒pEGFP-N1轉染MCF7細胞，通過Western印跡方法對轉染基因的蛋白質表達進行了鑒定，且未檢測到細胞內源性SGK3蛋白的表達。在隨后的細胞生長曲線中發現，轉染SGK3基因的細胞其生長速度明顯加快。本實驗RT-PCR結果顯示外源SGK3基因的過表達可使腫瘤細胞bcl-xl mRNA表達上調，bad mRNA表達下調，提示外源SGK3基因可通過影響凋亡相關基因的表達而抑制細胞凋亡。

1 Leong ML，Maiyar AC，Kim B，et al.Expression of the serum and glucocorticoid-inducible protein kinase，sgk is a cell survival response to multiple types of environmental stress stimuli in mammary epithelial cells〔J〕.J Biol Chem，2003;278(8)：5871-82.

2 Klaus F，Palmada M，Lindner R，et al.Up-regulation of hypertonicity-activated myo-inositol transporter SMIT1 by the cell volume-sensitive protein kinase SGK1〔J〕.J Physiol，2008;586(6)：1539-47.

3 Brickley DR，Mikosz CA，Hagan CR，et al.Ubiquitin modification of serum and glucocorticoid-induced protein kinase-1(SGK-1)〔J〕.J Biol Chem，2002;277(45)：43064-70.

4 Maier G，Palmada M，Rajamanickam J，et al.Upregulation of HERG channels by the serum and glucocorticoid inducible kinase isoform SGK3〔J〕.Cell Physiol Biochem，2006;18(4-5)：177-86.

5 Wang Y，Zhou D，Phung S，et al.SGK3 is an estrogen-inducible kinase promoting estrogen-mediated survival of breast cancer cells〔J〕.Mol Endocrinol，2011;25(1)：72-82.

6 Webster MK，Goya L，Ge Y，et al.Characterization of sgk，a novel member of the serine/threonine protein kinase gene family which is transcriptionally induced by glucocorticoids and serum〔J〕.Mol Cell Biol，1993;13(4)：2031-40.

7 Xu J，Liu D，Gill G，et al.Regulation of cytokine-independent survival kinase(CISK)by the Phox homology domain and phosphoinositides〔J〕.J Cell Biol，2001;154(4)：699-705.

8 Mauro TM，McCormick JA，Wang J，et al.Akt2 and SGK3 are both determinants of postnatal hair follicle development〔J〕.FASEB J，2009;23(9)：3193-202.

9 Campagna DR，Custodio AO，Antiochos BB，et al.Mutations in the serum/glucocorticoid regulated kinase 3(Sgk3)are responsible for the mouse fuzzy(fz)hair phenotype〔J〕.J Invest Dermatol，2008;128(3)：730-2.

10 Okada T，Ishii Y，Masujin K，et al.The critical roles of serum/glucocorticoid-regulated kinase 3(SGK3)in the hair follicle morphogenesis and homeostasis：the allelic difference provides novel insights into hair follicle biology〔J〕.Am J Pathol，2006;168(4)：1119-33.

11 Brunet A，Park J，Tran H，et al.Protein kinase SGK mediates survival signals by phosphorylating the forkhead transcription factor FKHRL1(FOXO3a)〔J〕.Mol Cell Biol，2001;21(3)：952-6.

12 Strutz-Seebohm N，Seebohm G，Mack AF，et al.Regulation of GluR1 abundance in murine hippocampal neurones by serum and glucocorticoidinducible kinase-3〔J〕.J Physiol，2005;565(Pt2)：381-90.