紫杉醇對膠質瘤SHG-44細胞的增殖抑制和輻射增敏作用

李 忠 侯吉光 蘇清秀 劉博宇 楊艷明 (吉林省腫瘤醫院放療科研究室，吉林 長春 300)

腦膠質瘤可導致患者出現致殘和腦功能缺失表現，死亡率很高。而目前臨床上對腦膠質瘤有效的化療藥物又很少，主要以放射治療和手術治療為主〔1〕。紫杉醇(Paclitaxel)可使細胞增殖周期阻滯于G2/M期，表達廣泛的抗腫瘤活性，還可增強某些腫瘤的輻射效應〔2，3〕，但紫杉醇對中樞神經系統腫瘤的輻射增敏作用尚有待進一步研究。本實驗觀察了紫杉醇對腫瘤細胞增殖抑制和輻射增敏作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品和細胞培養 紫杉醇由中科院長春應用化學研究所惠贈，以RPMI 1640培養液溶解。人膠質瘤SHG-44細胞系購自吉林大學醫學部生化與分子生物學教研室，用含10%新生牛血清的RPMI1640培養液(Gibco)，培養在37℃、5%CO2培養箱中，2～3 d傳一代。

1.2 細胞生長抑制實驗 取對數期生長的SHG-44細胞，0.25%胰酶消化，接種于96孔板，每孔100 μl(約2×104個細胞)，每孔分別加入不同濃度(0、0.062 5、1.25、2.5、5 和10 μg/ml)的紫杉醇溶液100 μl，每一濃度設8個復孔。分別在加藥1、3 和7 d 后，每孔加入MTT 10 μl(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入 DMSO(Sigma，美國)100 μl，室溫下搖床振蕩30 min，酶聯免疫檢測儀在490 nm波長處測定其吸光度(A值)，計算細胞生長抑制率。實驗重復3次。

1.3 輻射增敏實驗

1.3.1 照射條件 國產X射線治療機照射，電壓120 kV，電流15 mA，濾板 2 mm Al。球靶距 30 cm，吸收劑量率為0.62 Gy/min。

1.3.2 細胞處理 取對數期生長的SHG-44細胞，0.25%胰酶消化，接種直徑60 mm細胞培養皿，每皿1 ml細胞(約1×103個)，加入不同濃度(0、0.062 5、1.25、2.5、5 和 10 μg/ml)紫杉醇作用24 h，分別進行3 Gy與6 Gy X射線照射，繼續在CO2孵箱內培養14 d，觀察對照組出現肉眼可見的克隆后，用75%乙醇固定，Giemsa染色，計克隆數(含50個細胞以上)，并計算存活分數(SF)。實驗重復3次。SF=照射后細胞形成的集落數/(接種細胞數×未照射細胞集落形成數)。

1.4 流式細胞術檢測紫杉醇與輻射作用后細胞凋亡的變化取指數生長的SHG-44細胞，0.25%胰酶消化后，接種于6孔板，每孔細胞數為5×105，無血清RPMI 1640培養液培養進行細胞同步化后，用含10%新生牛血清RPMI 1640培養液培養24 h，不同濃度(0、0.625、1.25、2.5 和 5.0 μg/ml)紫杉醇作用24 h后，進行不同劑量(吸收劑量為3 Gy、6 Gy)X射線照射，24 h后終止培養，1 000 r/min離心后70%冰乙醇固定，-20℃保存。將制備好的單細胞懸液以1 000 r/min離心10 min，棄去固定液，冷PBS漂洗2次，調整細胞為1×109個/L，加入PI染液1.0 ml，避光染色30 min，流式細胞儀(Beckman，美國)檢測細胞凋亡百分率，數據用CellQuest軟件分析。

2 結果

2.1 紫杉醇對SHG-44細胞的生長抑制作用 MTT結果顯示，不同濃度的紫杉醇對SHG-44細胞的生長具有抑制作用，隨濃度增加，抑制效果明顯增強。統計學分析表明，紫杉醇的生長抑制作用隨著作用時間的延長明顯增加，1、3和7 d的抑制率之間比較差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

2.2 紫杉醇的輻射增敏作用 不同濃度紫杉醇及3 Gy和6 Gy X射線照射后，培養箱中培養14 d后，各組形成的克隆數明顯不同。不同濃度的紫杉醇作用24 h后，進行3 Gy和6 Gy X射線照射，不同輻射劑量組合的各組之間比較差異有統計學意義(P＜0.01);相同的輻射劑量、不同濃度的紫杉醇作用組之間比較差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖1。

2.3 紫杉醇作用后細胞凋亡的變化 應用紫杉醇能夠明顯提高放射對SHG-44細胞的殺傷作用，細胞凋亡率明顯高于單獨放射組，且隨著紫杉醇濃度的增加而增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

表1 不同濃度、作用時間的紫杉醇對SHG-44細胞的抑制率(n=6，s)

表1 不同濃度、作用時間的紫杉醇對SHG-44細胞的抑制率(n=6，s)

與作用時間1 d比較：1)P＜0.01

紫杉醇藥物濃度(μg/ml)1 d 3 d 7 d 0.625 12.88±1.33 27.22±3.591) 39.44±3.711)1.25 23.01±2.45 46.13±3.321) 51.89±3.101)2.5 32.56±2.79 54.11±2.151) 67.7±3.711)5.0 46.12±4.16 61.70±3.161) 70.40±3.271)10.0 59.45±3.01 69.85±3.061) 74.85±3.151)

圖1 SHG-44細胞在不同濃度紫杉醇與X射線照射聯合作用后克隆形成率變化

圖2 SHG-44細胞在不同紫杉醇與X射線照射聯合作用后24 h的細胞凋亡百分率

3 討論

膠質瘤是顱內最為常見的惡性腫瘤，發病率占顱內腫瘤的44%〔4〕。膠質瘤多浸潤性生長，手術很難將顱內侵襲灶完全切除，目前多采用手術、化學治療或放射治療聯合治療。因此最大限度殺傷腫瘤細胞成為膠質瘤綜合治療中的重要環節〔5，6〕。目前化療與放療并用起到協同的結果，以期改善惡性腫瘤的治療效果，并減少兩者的毒副作用。不少學者期望通過輻射增敏作用這一設想，尋找某些具有輻射增敏的化療藥物與放療相結合，這樣在減少放化療劑量、減輕各自副作用的同時達到同樣甚至更好的治療效果〔7〕。

根據本實驗結果可以推測應用低劑量的紫杉醇治療腫瘤既具有對腫瘤細胞的增殖抑制活性又有放射增敏特性，為下一步研究提供了良好的依據。紫杉醇聯合X射線照射作用于SHG-44細胞，在降低細胞集落形成率方面具有協同作用，提示紫杉醇在體外對SHG-44細胞具有輻射增敏作用，并且這種放射增敏作用具有劑量依賴性。

目前放射生物學研究表明細胞凋亡是放射治療的核心問題，凋亡調控機制在細胞放射敏感性方面起著重要作用。細胞放射敏感性在一定程度上取決于促進凋亡因素和抑制凋亡因素之間的相互作用，如果通過化學藥物促進凋亡的因素上調，那么細胞受到電離輻射后就很容易啟動凋亡通路，則放射敏感性就會增強。多數研究結果證明，凋亡反應的增加同時伴有細胞放射敏感性增高，凋亡的細胞具有更高放射敏感性〔8，9〕。本實驗證實紫杉醇在0.625～10 μg/ml范圍內作用后能增加SHG-44細胞對放射線的敏感性，且有濃度依賴性，凋亡率增加。由此推斷其可以促進放射損傷效應。而且有些研究證實它能使細胞周期阻滯在放射敏感的G2/M期，或通過改變細胞周期檢查點來增加放射誘導的凋亡，從而增加放射敏感性。因此，通過紫杉醇提高放射線誘導細胞凋亡率，可增強放射線的抗瘤作用〔10〕。

1 Drago-Ferrante R，Santulli A，Di Fiore R，et al.Low doses of paclitaxel potently induce apoptosis in human retinoblastoma Y79 cells by upregulating EF1〔J〕.Int J Oncol，2008;33(4)：677-87.

2 Kim ES，Khun FR.Docetaxel and radiation as combined modality therapy〔J〕.Oncology，2002;16(suppl)：97：105-10.

3 Mason KA，Milas L，Peters LJ.Effect of paclitaxel(taxol)alone and in combination with radiati on on the gastrointestinal mucosa〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，1995;32(5)：1381-9.

4 王忠誠.神經外科學〔M〕.武漢：湖北科學技術出版社，2005：512.

5 Kemper EM，Boogerd W，Thuis I，et al.Modulation of the blood-brain barrier in oncology：therapeutic opportunities for the treatment of brain tumours〔J〕.Cancer Treat Rev，2004;30：415-23.

6 Zeng SY，Li LY，Shu KY，et al.Chemoradiotherapy versus radiotherapy in advanced cervical carcinoma〔J〕.Ai Zheng，2008;27(9)：942-6.

7 Schuck A，Muller SB，Kohler A，et al.Combined radiochemotherapy with paclitaxel in the treatment of malignant glioma〔J〕.Strahlenther Onkol，2002;178(9)：486-90.

8 Mason KA，Hunter NR，Milas M，et al.Docetaxel enhances tumor radio response in vivo〔J〕.Clin Cancer Res，1997;3(12Pt1)：2431-8.

9 Supiot S，Gouard S，Charrier J，et al.Mechanisms of cell sensitization to alpha radioimmunotherapy by doxorubicin or paclitaxel in multiple myeloma cell lines〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(19Pt 2)：7047-52.

10 Gupta N，Hu LJ，Deen DF.Cytotoxicity and cell-cycle effects of paclitaxel when used as a single agent and in combination with ionizing radiation〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，1997;37：885-95.