雞胚蛋中水溶性維生素的測定及其孵化期間的變化

范 亮張 彧陳歷俊姜鐵民

（1.大連工業大學，遼寧 大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085）

雞胚蛋中水溶性維生素的測定及其孵化期間的變化

范 亮1，2張 彧1陳歷俊1姜鐵民2

（1.大連工業大學，遼寧 大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085）

對雞胚蛋中水溶性維生素的色譜測定方法進行優化和驗證，5種維生素的加標回收率均在90%以上，且在0.1～50μg/mL具有良好的線性相關性；采用RP－HPLC對不同胚齡（即入孵的第0、2、4、6、8、10、12、14、16和18天）肉雞胚胎發育過程中的5種水溶性維生素（核黃素、煙酸、煙酰胺、吡哆醇和葉酸）進行測定與分析，并與鮮蛋進行對比。結果表明，隨著孵化時間的延長，維生素B2、煙酸和葉酸3種維生素均有不同程度的增加，其中煙酸增加3.2倍，維生素B2增加31%；葉酸在12d達到最高，比鮮蛋約增加1倍；未能檢測出維生素B6和煙酰胺。

雞胚蛋；水溶性維生素；核黃素；煙酸；葉酸

雞胚蛋是受精雞蛋孵化至一定天數后，還未破殼，可食用的雞蛋，據《本草綱目》記載：“雞胚蛋有治療頭痛、偏頭痛、頭風病及四肢瘋障之功能。”民間早有食用的習慣，俗稱“喜蛋”、“毛蛋”、“活珠子”等。而一個受精雞蛋能否正常發育，除了要求有正常的孵化條件外，在一定程度上還取決于孵化期間內營養成分的變化情況，因此弄清各種營養的代謝變化規律，對調控禽類胚胎發育，提高孵化率有著重要的意義。

已有學者對雞胚蛋孵化期間的營養變化情況進行了研究：李利東等［1］研究發現雞胚蛋孵化期間多種對人體有益的營養元素均有所增加，如牛磺酸增加了將近20倍，VE增加了100倍，鈣含量增加6倍多等，而對人體不利的脂肪含量下降50%，膽固醇下降5.5倍等，其研究結果與李國喜等的研究［2，3］基本一致；劉娟娟［4］比較了不同品種雞胚蛋孵化期間營養物質的變化規律情況，發現不同品種的雞胚蛋在孵化期間變化規律也略有不同，但總體趨勢相似；房興堂等［5］還對雞胚蛋的蛋白質脂肪的轉化轉移進行了一定的研究，發現胚胎中的蛋白質和脂肪主要來源于蛋黃。但目前還沒有對雞胚蛋中的一些重要的水溶性維生素進行研究的報道，如參與體內脂質代謝，組織呼吸的氧化過程和糖類無氧過程的煙酸和煙酰胺；參與神經遞質、糖原、核酸以及所有氨基酸代謝的維生素B6以及對神經細胞與腦發育有促進作用的葉酸等。因此，本試驗分別對不同胚齡雞胚蛋中的維生素B2，煙酸、煙酰胺、維生素B6以及葉酸進行檢測分析，旨在為人們食用雞胚蛋提供科學依據，同時也對雞胚蛋的深加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品取自北京華都食品有限公司，分別取無精蛋、鮮蛋、0，2，4，6，8，10，12，14，16，18d胚齡雞蛋，去殼后用高速勻漿機混勻，并分裝于－20℃保存待測

1.2 主要試劑

鹽酸吡哆醇、葉酸、煙酸、煙酰胺和核黃素標準品：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

三氟乙酸：色譜純，美國Tedia公司；

乙腈：色譜純，美國Fisher公司；

水：市售娃哈哈純凈水；

其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

高效液相色譜儀：含LC－10ATVP二元泵，SPD10Avp紫外檢測器，classvp軟件，日本Shimadzu公司；

雙光束紫外可見光分光光度計：Cintra20，澳大利亞GBC公司；

冷凍離心機：2K15，美國Sigma公司；

C18色譜柱：Venusil XBP C18，天津博納杰艾爾科技有限公司。

1.4 標準溶液配制

1.4.1 煙酸、煙酰胺、吡哆醇 分別取煙酸、煙酰胺和吡哆醇溶液50mg于50mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度［6］。

1.4.2 葉酸 稱取10mg葉酸，溶解于0.01mol/L氫氧化鈉乙醇溶液（乙醇∶水＝1∶4）并定容至100mL［7］。

1.4.3 核黃素 取50mg核黃素溶于0.02mol/L乙酸溶液中，并定容至500mL棕色容量瓶中［8］。

1.5 樣品提取

1.5.1 核黃素、煙酸、煙酰胺和吡哆醇 參照文獻［9］提取煙酸、煙酰胺和維生素B6，并稍加改動，稱取樣品1～2g于150mL三角瓶中，加入0.1M鹽酸溶液，于121℃水解30min，冷卻后，以2.5M乙酸鈉調pH至4.5，轉入50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，用0.22μm過濾后待測。

1.5.2 葉酸 參照文獻［10］并稍加改動，稱取1～2g樣品于150mL三角瓶中，加入0.026mol/L Tric－HCl緩沖溶液（pH 7.4）含有1% （m/V）抗壞血酸鈉20mL，121℃高壓水解20min，轉移至50mL容量瓶中，加入5%三氯乙酸5mL，用超純水定容至刻度，混勻于4℃6 000r/min離心20min，上清液經過0.22μm濾膜過濾貯存于4℃待測。

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

采用等度洗脫，流動相為三氟乙酸（TFA）水溶液（含1g/L庚烷磺酸鈉）和乙腈，選用反相C18色譜柱5μm（4.6mm×25cm），本試驗研究了不同濃度（3%～40%）乙腈對樣品出峰時間的影響，發現高濃度乙腈能縮短出峰時間，但是會導致煙酸和煙酰胺無法分離，較低濃度乙腈會延長保留時間。由圖1可知，當乙腈濃度為10%時，可較好的分離核黃素、煙酸、煙酰胺和吡哆醇。由圖2可知，當乙腈濃度為15%時，葉酸在25min內可出峰，且樣品分離效果良好，故將檢測葉酸的最適乙腈濃度定為15%。此外，流動相的pH 對分離水溶性維生素也至關重要［11］，Ciul.M 等［12］采用0.025%TFA水溶液和乙腈梯度洗脫檢測蜂蜜中的水溶性維生素，得到了較好的結果。本試驗研究了不同濃度的TFA（0.025%～0.1%）對維生素分離的影響，結果表明在較低濃度TFA下葉酸和維生素B2均有拖尾現象，在濃度升至0.1%時，能較好的解決拖尾問題，且分離效果良好。

圖1 標準混合液及雞胚蛋提取液色譜圖Figure 1 Chromatograms of a standard mixture of nicotinamide，nicotinic acid，riboflavin，pyridoxin and embryoed eggs

在190～500nm下對5種維生素進行波長掃描，其最大吸收波長分別為核黃素260nm、鹽酸吡哆醇290nm、煙酸和煙酰胺260nm、葉酸255nm，為方便試驗，將鹽酸吡哆醇的吸光值設為290nm，其余均為260nm，該結果也與田穎等的研究［13］一致，柱溫采用 25 ℃［12，14，15］。

由圖1還可知，4種水溶性維生素的保留時間分別為煙酰胺tR＝15.3min、煙酸tR＝18.2min、核黃素tR＝38.1min和吡哆醇tR＝38.4min，但是在樣品中沒有發現煙酰胺和吡哆醇，在食物營養成分表中也未查到雞蛋中煙酰胺和吡哆醇含量，這也與本試驗的研究結果一致。由圖2還可知，葉酸的保留時間為tR＝21.4min。

2.2 方法驗證

2.2.1 檢出限 進空白樣品，以基線3倍噪聲值在標準曲線差得結果計算，測得5種維生素的檢出限分別為核黃素0.12μg/mL、煙酸0.075μg/mL、煙酰胺0.06μg/mL、吡哆醇0.045μg/mL、葉酸0.09μg/mL（表1），而 Lebiedzinska等［14］所得各種維生素的檢測限在0.19～9.2ng/mL，與本試驗結果有較大出入，可能是儀器的不同而造成的。

2.2.2 線性范圍 將逐級稀釋的維生素混合標準工作液分別進樣10μL，測得結果以峰面積為Y對質量濃度x（μg/mL）作圖，結果見表1。由表1可知，各種維生素在0.1～50μg/mL線性關系良好。

圖2 葉酸標準品溶液和雞胚蛋提取液色譜圖Figure 2 Chromatograms of a standard solution and embryoed eggs

表1 方法驗證Table 1 Validation data

2.2.3 精密度和回收率 在上述試驗條件下，取混合標準樣品溶液5.0μg/mL，進樣量10μL，平行測定5次，計算其變異系數，同時取已知濃度的樣品，分別加入樣品濃度的50%，100%，150%的混合標準溶液，按1.5的方法制備后進行測定，結果（見表1）5種維生素的變異系數在3.34～6.18（n＝5），回收率均在90%以上，Ciulu等［12］研究表明各種維生素的回收率在90%～110%，變異系數在2.6～7.6，也與本試驗結果基本一致。

2.3 不同胚齡雞胚蛋中水溶性維生素的含量

通過與水溶性維生素標準混合液的保留時間的對比并向樣品提取溶液中加入已知濃度標準溶液來確定樣品中含有相應的維生素。之后對混標進行分析，待各個樣品完全分離后再分別對單個樣品進行分析以確定各個物質的出峰時間，外標法定量。在線性范圍內選取5個不同的濃度制作各個維生素的標準曲線，結果見表2。

表2 不同孵化期間雞胚蛋水溶性維生素含量變化+Table 2 Average concentration of water－soluble vitamins of different period embroyed eggs origin /（mg·kg－1）

由表2可知，雞胚蛋中維生素含量有所差別，其中以煙酸最多、葉酸次之、維生素B2最少，煙酰胺和維生素B6含量低于檢測限。

如果雞胚蛋中缺乏核黃素，在孵化至10～14d時會發生雞胚死亡。在孵化過程中所檢測的維生素B2的含量增加了31.2%，這與劉娟娟的研究結果［4］略有出入，她所檢測的4個品種的雞胚蛋在孵化過程中維生素B2含量均略有降低，但是變化不顯著，這可能與維生素B2主要以黃素蛋白的輔酶形式參與生理生化代謝有關［16］，自身含量損失不大。

煙酸含量增加3.7倍，且在0～12d煙酸含量增加緩慢，在12d后迅速增加，一方面這與雞胚蛋在孵化12d后胎兒開始大量吞食蛋白羊水導致水分急劇下降有關［1，4］，因未發現煙酰胺，故煙酸的增加含量并非是煙酰胺轉化而來，而在動物體內，色氨酸可以轉化為煙酸，且轉化率與肝臟中的色氨酸加氧酶有很大關系。研究［17］表明，雞胚在12d時肝臟生長速度開始加快，有可能在肝臟增重的過程中增加了色氨酸加氧酶的分泌從而促進了色氨酸－煙酸的轉化。

在孵化過程中，葉酸的含量呈現“先增加后減小”的趨勢，且在第12天含量達到最大，比鮮蛋約增加一倍，因為葉酸無法在體內合成和轉化，所以可能的原因是在整個孵化過程中胚蛋內水分含量大大降低，從而導致干物質含量上升［1，4］，而隨著孵化的進行，至10～11d時，胚胎的心臟、肝臟和大腦等器官生長速度開始加快，并于16d時達到生長高峰期［17］，在此過程中雞胚DNA的合成，神經系統的發育以及氨基酸的代謝均發生了很大變化，而這些生理反應變化均依賴葉酸的參與進行，因此在12d后，葉酸的含量一直處于逐漸降低。從另一方面講，如果從補充葉酸含量來考慮，應該選取12d之前的雞胚蛋。

3 結論

各種維生素在0.1～50μg/mL均有良好的線性關系，檢測限分別為核黃素0.12μg/mL，煙酸0.075μg/mL，煙酰胺0.06μg/mL，吡哆醇0.045μg/mL，葉酸0.09μg/mL，變異系數在3.34～6.18且回收率均在90%以上。該方法同樣也可用來分析蛋制品的水溶性維生素含量。檢測了不同孵化期間雞胚蛋中水溶性維生素的含量變化情況，在孵化過程中核黃素、煙酸和葉酸的含量均有不同程度的增加，其中煙酸含量增加最多，約增加3.2倍，核黃素增加不明顯，而葉酸在12d時達到最大，并在12d后逐漸降低，整個孵化過程中均未發現煙酰胺和吡哆醇。

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7 中華人民共和國國家標準.GB/T 5009.211——2008食品中葉酸的測定［S］.北京：中國標準出版社，2009.

8 中華人民共和國國家標準.GB/T 9695.28——2008肉與肉制品維生素B2的測定［S］.北京：中國標準出版社，2009.

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Detection of water－solution vitamins in embroynated eggs and its changes during incubate

FAN Liang1，2ZHANG Yu1CHEN Li－jun1JIANG Tie－min2

（1.Dalian Polytechnology University，Dalian，Liaoning116034，China；2.Beijing Sanyuan Co.，Ltd，Beijing100085，China）

The assessment and validation of reliable and analytical method for the determination of water－solution vitamins，The recovery of the five kinds of vitamins are more than 90%and it appears a very good linearity during 0.1～50μg/mL。A RP－HPLC method was put to use to detect five water－soluble vitamins（riboflavin，、niacin、niacinamide、pyridoxin folic acid）in different incubate period（the 0th，2th，4th，6th，8th，10th，12th，14th，16thand 18thday after incubate）embroynated eggs and made a comparison with the fresh egg，the results indicated that as the incubate goes on，the content of riboflavin、niacin and folic acid had made a increase at different level，the content of niacin in the 18thday of embroynated eggs is 3.2times than fresh eggs，as to riboflavin，this amount is 31%，the biggest content of folic acid appears the 12thday，it is the twice amount of the fresh eggs，both of the pyridoxin and niacinamide were below the limit of detection.

embroynated eggs；water－solution vitamin；riboflavin；niacin；folic acid

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.010

國家“863”計劃（編號：2011AA100903）；北京市科技計劃（編號：D10110504600000）

范亮（1985－），男，大連工業大學在讀碩士研究生。E－mail：fanliang24233＠163.com

陳歷俊

2011－12－01