三種色譜法分析鮑魚生殖腺多糖的單糖組成

宋葉涵李冬梅，2楊靜峰，2朱蓓薇，2

（1.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家貝類加工技術研究分中心（大連），遼寧 大連 116034）

三種色譜法分析鮑魚生殖腺多糖的單糖組成

宋葉涵1李冬梅1，2楊靜峰1，2朱蓓薇1，2

（1.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家貝類加工技術研究分中心（大連），遼寧 大連 116034）

為了選擇一種準確有效的方法測定鮑魚生殖腺多糖（AGP－32）的單糖組成。采用薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法對AGP－32的單糖組成進行測定。結果表明：高效液相色譜法較其它色譜方法具有分離效果好，并可同時檢測中性糖、糖醛酸和氨基糖等特點，并利用該法得到單糖組成的摩爾比為 Man∶Rha∶GlcA∶GalA∶Glc∶Gal∶Xyl∶Fuc＝0.79∶2.05∶1.6∶0.58∶0.09∶4.91∶0.11∶0.34。說明高效液相色譜法較其它色譜法更加適合于鮑魚生殖腺多糖這類復雜樣品的單糖組成分析。

鮑魚；生殖腺多糖；硫酸酯多糖；單糖組成；薄層色譜法；氣相色譜法；高效液相色譜法

鮑魚屬軟體動物門、腹足綱，是名貴的海珍品，具有豐富的營養價值和藥用價值［1］。鮑魚生殖腺多糖是從鮑魚生殖腺中分離得到的硫酸酯多糖。近年來的研究［2－7］表明，鮑魚生殖腺多糖具有一定的抗氧化、增強免疫和抗腫瘤及抗凝血等活性。鮑魚生殖腺多糖結構復雜、生物活性多樣，療效明顯，因此有必要對其結構進行深入的研究。單糖組成分析作為研究多糖結構的基礎，因而成為一項亟待解決的問題。

本試驗通過薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法3種衍生化方法，對鮑魚生殖腺多糖的單糖組成進行定性和定量分析，并對不同的衍生化方法的特點和測定結果進行比較分析，為今后準確和有效地選用這些方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鮑魚生殖腺：大連獐子島漁業有限公司；

D－甘露糖、D－半乳糖、D－葡萄糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、L－阿拉伯糖、D－葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、D－氨基葡萄糖鹽酸鹽共10種單糖標準品：美國Sigma公司；

三氟乙酸、三氯甲烷和甲醇：均為色譜純；

1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）、吡啶、鹽酸羥胺、乙酸酐、六甲基二硅胺烷、硼氫化鈉、醋酸、碳酸鈉、正丙胺、三甲基氯硅烷：均為分析純試劑。

1.2 主要儀器

氣相色譜儀：6890N，美國Agilent公司；

石英毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm）：HP－5，美國Agilent公司；

高效液相色譜儀：LC－10Avp，日本島津公司；

Tigerkin C18柱（4.6mm×250mm，5μm）：Tigerkin系列液相色譜柱，大連思普精工有限公司；

氮氣吹干儀：DN－12A，天津市樂康科技有限公司。

1.3 鮑魚生殖腺多糖的分離純化

依據本課題組［1］前期建立的蛋白酶水解提取法提取鮑魚生殖腺粗多糖（abalone gonad polysaccharide，AGP）。將提取的鮑魚生殖腺多糖以Sevag法去除蛋白，采用Cellulose DEAE－52柱和Sepharose CL－6B柱，收集得到純度良好的鮑魚生殖腺多糖（AGP－32）。

1.4 薄層色譜法

準確稱取20mg AGP－32溶于2mL 2mol/L的硫酸中，在100℃下，水解6h，用BaCO3中和至中性，4 000r/min離心10min、取上清液。分別稱取10mg的葡萄糖、木糖、巖藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖及混合標準單糖，并分別加入2mL蒸餾水溶解。點樣量為2μL，在貯有展開劑正丁醇∶水∶乙醇（3∶2∶5）的展開箱中，上行展開，展距10cm。從展箱中取出薄板，吹干，放入顯色劑乙醇∶濃硫酸 （9∶1）水溶液中，取出吹干，100℃加熱顯色約8min［8］。

1.5 氣相色譜法

1.5.1 糖腈乙酸酯衍生化法

（1）多糖的水解：準確稱取10mg AGP－32溶于2mL 2mol/L的三氟乙酸中，充N2密封，在100℃下水解4h，反復加甲醇并用N2吹干，作為AGP－32水解產物備用。

（2）單 糖的衍生化［9］：向 AGP－32水解產物中，加入8mg鹽酸羥胺、0.5mL吡啶、1mg肌醇，漩渦振蕩后，于90℃水浴中加熱30min，取出后冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，在90℃恒溫水浴乙酰化30min，反應產物經0.45μm濾膜過濾后注入氣相色譜進行分析；標準單糖作同法處理，并制成標準單糖衍生物混合液。

（3）色譜條件：HP－5石英毛細管色譜柱；載氣為N2；采用氫火焰離子檢測器（FID），進樣口氣化溫度250℃，檢測溫度250℃，柱溫采用程序升溫：從0min到5.00min為130℃，然后以4.00℃/min的速度由130℃升至240℃保留10.00min。

1.5.2 三甲基硅醚衍生化法

（1）多糖的水解［1］：準確稱取10mg AGP－32，加入2mL無水HCl－甲醇，充N2封管，80℃甲醇解20h。反應完成后，冷卻至室溫，以無水KOH－甲醇中和至pH 6.0，減壓蒸干，常規干燥，作為AGP－32甲醇解產物備用。

（2）單糖的衍生化［1］：向 AGP－32甲醇解產物中加入0.2mL無水吡啶（內含飽和甘露醇，作內標），振蕩搖勻，于恒溫干燥箱75℃溶解30min，再振蕩均勻，加入0.3mL硅烷化試劑六甲基二硅胺烷∶三甲基氯硅烷（2∶1），振蕩，靜置30min，3 000r/min離心10min，取上清液進行氣相色譜分析；標準單糖作同法處理，并制成標準單糖衍生物混合液。

（3）色譜條件：HP－5石英毛細管色譜柱；載氣為N2；氫火焰離子檢測器（FID），進樣口氣化溫度250℃，檢測溫度250℃，柱溫采用程序升溫：從0min到1min為150℃，然后以10℃/min的速度升至182℃，保持2min，再以1℃/min的速度升至188℃，保持1min，最后以8℃/min的速度升至230℃。

1.6 PMP柱前衍生化高效液相色譜法

1.6.1 多糖的水解 參照文獻［10］。稱取2mg AGP－32溶于1mL 2mol/L的三氟乙酸，充N2密封，于121℃水解2h，取出后加無水甲醇，N2吹干，作為AGP－32水解物備用。

1.6.2 衍生化標記 參照文獻［10］。分別稱取甘露糖、葡萄糖、D－氨基葡萄糖及半乳糖各0.001 8g，鼠李糖及巖藻糖各0.001 6g，木糖及阿拉伯糖各0.001 5g，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸各0.001 9g，混合，作為混合標準單糖備用。將AGP－32水解物、10種標準單糖（各10mg）和混合標準單糖，溶于5mL氨水中，取該溶液100μL與100μL的PMP/甲醇溶液（0.5mol/L）混合，在70℃下反應30min。取出后冷卻至室溫，加入1.5mL純水，真空干燥，重復2次。干燥后的物質用1mL純水及1mL氯仿溶解，充分振蕩后除去有機相，重復3次，靜置30min，取上清液進行HPLC分析。

1.6.3 色譜條件 色譜柱 Tigerkin C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流 動 相 0.1mol/L 磷 酸 鹽 緩 沖 液（Na2HPO4－NaH2PO4，pH 6.7）－乙腈（83∶17），流速1mL/min；檢測波長254nm；柱溫30℃；標準品進樣體積10μL，樣品進樣體積20μL。

2 結果與討論

2.1 薄層色譜法測定結果

采用TLC法測定AGP－32單糖組成的結果見圖1。根據各單糖標準品的Rf值和所顯顏色，可以初步確定AGP－32主要由鼠李糖和半乳糖組成，但由于個別單糖的顯色斑點有重疊，因此難以分辨AGP－32中可能含有的其它單糖。

圖1 AGP－32多糖水解物薄層色譜圖Figure 1 TLC chromatogram of AGP－32hydrolysates

2.2 氣相色譜法測定結果

2.2.1 糖腈乙酸酯衍生化法測定結果 標準單糖的糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜圖見圖2。由圖2可知，該法得到的單糖出峰時間短，峰形對稱，未出現拖尾現象，并且得到較好的基線分離效果。AGP－32多糖水解成單糖后的糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜圖見圖3。根據圖2和圖3的出峰時間進行對照，再經歸一化法求得各單糖組成的摩爾比為鼠李糖∶巖藻糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖 ＝1.34∶0.54∶0.26∶1.10∶0.11∶5.91。

圖2 標準單糖糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖Figure 2 GC chromatogram of aldoononitrile acetate derivatives of monosaccharide standards

圖3 AGP－32水解后糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜圖Figure 3 GC chromatogram of aldoononitrile acetate derivatives after acidic hydrolysis

2.2.2 三甲基硅醚衍生化法測定結果 標準單糖的三甲基硅醚衍生物氣相色譜圖見圖4。三甲基硅醚化衍生物具有揮發性好，制備簡單、反應迅速的優點［11］，但由圖4可知，該法產生了較多的異構峰，給多糖的定性和定量帶來了一定的困難。AGP－32多糖水解成單糖后的三甲基硅醚衍生化物氣相色譜圖見圖5。對照圖4和圖5的單糖出峰時間，經歸一化法計算得各單糖的組成摩爾比為鼠李糖∶巖藻糖∶甘露糖∶半乳糖 ＝0.71∶1.73∶0.3∶17.97。此結果與2.2.1比較可知，三甲基硅醚衍生化法未能得到完整的單糖組成信息。

2.2.3 高效液相色譜法測定結果 標準單糖的PMP衍生物的高效液相色譜圖見圖6，采用柱前衍生化高效液相色譜法進行分析時，各單糖間具有理想的分離度，并且PMP峰未掩蓋單糖峰。AGP－32多糖水解成單糖后的PMP衍生物的高效液相色譜圖見圖7。

根據各單糖標準品的出峰時間，可確定AGP－32是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖組成的雜多糖。根據標準單糖的峰面積之比，采用歸一化法求得AGP－32中單糖組成的摩爾比為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶巖藻糖＝0.79∶2.05∶1.6∶0.58∶0.09∶4.91∶0.11∶0.34。從峰面積百分比可以看出，鼠李糖和半乳糖在該多糖中所占比例較大，是鮑魚生殖腺多糖的主要成分，這與氣相色譜法分析單糖組成得到的結果基本一致。

圖4 標準單糖三甲基硅醚衍生物的氣相色譜圖Figure 4 Gas chromatograms of TMS derivatives of monosaccharide standards

圖5 組分AGP－32三甲基硅醚衍生物的氣相色譜圖Figure 5 Gas chromatograms of TMS derivatives of monosaccharide of AGP－32

圖6 混合標準單糖的PMP衍生物的色譜分離圖Figure 6 Chromatograms of PMP derivatives of monosaccharide standard samples

圖7 AGP－32水解后的PMP衍生物的色譜分離圖Figure 7 Chromatograms of PMP derivative of hydrolysate of fraction AGP－32

3 討論

采用薄層層析法與各單糖標準品的Rf值和所顯顏色進行比較，可以初步確定AGP－32主要含有鼠李糖和半乳糖，但由于部分單糖的顯色斑點有重疊，因此難以分辨是否含有其他單糖。采用TLC測定單糖組成具有操作簡便、快捷等優點，但分辨率不高，一般只作定性或半定量分析。

氣相色譜分析主要是利用試樣中各組分在色譜柱氣相和液相間的分配系數不同而進行的。同種單糖經不同的衍生化處理后得到不同的衍生產物，出現極性差異，保留時間發生較大變化［12］。

三甲基硅醚衍生化法具有制備簡單，反應迅速，衍生物揮發性好等特點，但是該法易產生多種衍生物的異構體，給定性和定量帶來一定的困難。本試驗結果表明，采用三甲基硅醚衍生化法并未得到完整的AGP－32單糖組成信息，其中未檢測到葡萄糖，而半乳糖含量相對較高。這很可能是由于D－葡萄糖和D－半乳糖是異構體，而這二種構型相近的己糖可能形成相同的二肟，因此這二個糖的二肟三甲基硅醚衍生物得到一個峰［13］。

糖腈乙酸酯衍生化法反應時間短，各峰分離效果好，異構峰相對較少，單糖組成定性及定量準確，其中單糖組分中含量較高的是鼠李糖、半乳糖和甘露糖，這與薄層色譜法和三甲基硅醚衍生化法測定結果一致。但此法僅適合于醛糖的分析，酮糖因缺乏還原端而難以衍生，糖醛酸與氨基糖也不適用于此法［14］。對酮糖的分析可選用三甲基硅醚衍生化方法。

高效液相色譜法通過導入具有紫外或熒光的化學基團對糖類進行柱前衍生，其優點是可以在溫和的條件下與還原糖鏈進行定量反應，生成在紫外245nm處有強烈吸收的衍生物，而且產物無立體異構現象［14］。本試驗采用PMPHPLC法測定AGP－32多糖的單糖組成，不僅可以檢測出鼠李糖、甘露糖和半乳糖等中性糖，而且還可同時檢測葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，并可進行定量分析。該法得到的單糖組成結構信息完整，定性準確，其中鼠李糖與半乳糖比例相對較高，此現象與以上幾種方法所得結論相符，因此高效液相色譜法較薄層色譜法和氣相色譜法更適合于單糖組成較為復雜的樣品分析。

4 結論

薄層色譜法操作快捷有效、無需衍生化處理，但單糖間的分離效果較差，比較適合對單糖組成較為簡單的樣品進行定性分析。氣相色譜法和高效液相色譜法檢測靈敏度高、分離效果好、定量準確，但氣相色譜法不適合糖醛酸和氨基糖的分析。高效液相色譜法可同時檢測AGP－32中中性糖、糖醛酸和氨基糖，較其它單糖組成測定方法更加適合于像鮑魚生殖腺多糖這種復雜樣品的單糖組成分析。

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Comparison of three chromatographic methods for monosaccharide composition analysis of abalone gonad polysaccharide

SONG Ye－han1LI Dong－Mei1，2YANG Jing－feng1，2ZHU Bei－wei1，2

（1.School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian，Liaoning116034，China；2.National R＆D Branch Center for Shellfish Processing（Dalian），Dalian，Liaoning116034，China）

To find an accurate and effective method to determine the monosaccharide composition of polysaccharide from abalone gonad（AGP－32）.Thin layer chromatography，gas chromatography and high performance liquid chromatography were used to determine the monosaccharide composition of AGP－32.Results：Method of high performance liquid chromatography had good resolution，and it was suitable to simultaneous analyses of neutral，acidic and alkaline monosaccharide.The monosaccharide composition of AGP－32which identified by this method was Man∶Rha：GlcA∶GalA∶Glc∶Gal：Xyl∶Fuc＝ 0.79：2.05∶1.6：0.58∶0.09：4.91∶0.11∶0.34.Conclusion：High performance liquid chromatography is more suitable than other chromatographic methods to complicated monosaccharide composition analysis of polysaccharide such as abalone gonad polysaccharide.

abalone；gonad polysaccharide；sulfated polysaccharide；monosaccharide composition；thin layer chromatography；gas chromatography；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.011

國家自然科學基金項目（編號：31171635）

宋葉涵（1987－），女，大連工業大學在讀碩士研究生。E－mail：songyehan＿2007＠126.com

楊靜峰

2012－01－01