CGTase合成γ－環(huán)糊精的酶促反應(yīng)條件優(yōu)化

曹新志劉 芳明紅梅金征宇

（1.四川理工學(xué)院食品與生物技術(shù)應(yīng)用研究所，四川 自貢 643000；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214036）

CGTase合成γ－環(huán)糊精的酶促反應(yīng)條件優(yōu)化

曹新志1劉 芳1明紅梅1金征宇2

（1.四川理工學(xué)院食品與生物技術(shù)應(yīng)用研究所，四川 自貢 643000；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214036）

采用篩選到的一株嗜堿芽孢桿菌，研究它所產(chǎn)生的環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)環(huán)糊精的工藝條件，重點探討酶促反應(yīng)條件對環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)γ－環(huán)糊精的影響。結(jié)果表明：環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)γ－環(huán)糊精的最佳工藝為反應(yīng)體系的pH 8.0，溫度60℃，環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的酶量500U/g·淀粉，甘草酸濃度2%，淀粉的DE值6～11，在該條件下制備的產(chǎn)品得率最高；蕉藕淀粉和木薯淀粉在生產(chǎn)γ－環(huán)糊精時是環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶比較合適的底物；普魯藍(lán)酶對γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量增加作用有限。

嗜堿芽孢桿菌；環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶；γ－環(huán)糊精

γ－環(huán)糊精（γ－cyclomaltodextrin，γ－CD），是淀粉等碳水化合物通過環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶催化水解等作用而生成的，它是由8個1，4－α－D－糖 苷 鍵 連 接 的 吡 喃 葡 萄 糖 殘 基［1－3］，具 有“內(nèi)疏水，外親水”的特殊立體空腔結(jié)構(gòu)。因此，環(huán)糊精這種特殊的立體結(jié)構(gòu)可以使其與許多化合物形成絡(luò)合物。水溶性較差的物質(zhì)或其基團(tuán)都能包絡(luò)在環(huán)糊精的空穴里，因此環(huán)糊精可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品和日用化學(xué)品等領(lǐng)域［4－6］。

目前已有采用菌株來生產(chǎn)γ－CD的報道［7－9］，但是其得率不高，生產(chǎn)成本較高，無法工業(yè)化生產(chǎn)。本試驗采用一株嗜堿芽孢桿菌1177菌株經(jīng)誘變處理后，經(jīng)特定的方法篩選得到突變株12－7［10］，其酶活力顯著提高。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

α－CD、β－CD、γ－CD標(biāo)樣：美國Sigma公司；

環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶液：本實驗自制；

α－淀粉酶、普魯藍(lán)酶（Pullulanase）：美國杰能科（無錫）公司；

馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉、蕉藕淀粉和甘草：市售。

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀：1100型，美國Agilent公司；

酸度計：868型，熱電（上海）儀器有限公司；

加熱循環(huán)槽：MP－13H，上海一恒科技有限公司

1.3 方法

1.3.1 環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶液的制備 將一株嗜堿芽孢桿菌Bacillus alkalophilus12－7斜面菌種接種到30mL的三角瓶（培養(yǎng)基為1%可溶性淀粉，5%玉米漿，0.1%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，pH 10.3）中，在30 ℃，250r/min搖瓶培養(yǎng)72h，然后離心（5 000r/min）得上清液，即為粗酶液。

1.3.2 甘草酸的提取 參照文獻(xiàn)［11］。將一定量的甘草酸加3倍的水，于冰箱中靜置2d后，用紗布過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在50℃下蒸發(fā)濃縮，再將濃縮液置于80℃干燥箱中烘烤48h后備用。

1.3.3 淀粉的水解 參照文獻(xiàn)［12］。將蕉藕淀粉用一定量α－淀粉酶在95℃進(jìn)行水解，在不同水解時間測定DE值。

1.3.4 測定項目及方法

（1）CGTase活性的測定：參照文獻(xiàn)［13］。

（2）環(huán)糊精測定分析：參照文獻(xiàn)［14］。

（3）還原糖的測定：采用3，5－二硝基水楊酸（DNS）法［15］。

（4）DE值的計算：參照文獻(xiàn)［16］，按式（1）計算：

式中：

A——直接還原糖，%；

B—— 總固形物，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

在pH 8.0，淀粉濃度5%，加酶量500U/g·淀粉，甘草酸2%的條件下，分別于45，50，55，60，65，70，75 ℃反應(yīng)12h，以γ－環(huán)糊精產(chǎn)量為評價指標(biāo)，確定最佳反應(yīng)溫度。由圖1可知，隨反應(yīng)溫度的升高，γ－環(huán)糊精產(chǎn)量先增加，反應(yīng)溫度在60℃時γ－環(huán)糊精產(chǎn)量最高，隨反應(yīng)溫度的進(jìn)一步升高，γ－環(huán)糊精產(chǎn)量又逐步降低。因此，最佳反應(yīng)溫度為60℃。

圖1 溫度對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響Figure 1 Effect of temperature on the output ofγ－CD

2.2 pH對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

在反應(yīng)溫度60℃，加酶量500U/g·淀粉，淀粉濃度5%，甘草酸2%，反應(yīng)12h的條件下，分別考察不同pH（5.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0）對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響。由圖2可知，隨pH的升高，γ－環(huán)糊精產(chǎn)量先增加，pH在8時γ－環(huán)糊精產(chǎn)量最高，隨pH的進(jìn)一步升高，γ－環(huán)糊精產(chǎn)量又逐步降低。因此，最佳反應(yīng)pH為8。

2.3 環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的酶量對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

為了確定最適酶的添加量，每克蕉藕淀粉分別用200，300，400，500，600，700，800U的酶進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為溫度60℃，pH 8.0，淀粉濃度5%，甘草酸2%，反應(yīng)12h后進(jìn)行測定。由圖3可知，當(dāng)酶的添加量逐步增加時，γ－環(huán)糊精產(chǎn)量也隨之增加，但加酶量大于500U/g·淀粉后，γ－環(huán)糊精產(chǎn)量增加不多，因此，加酶量以500U/g·淀粉為宜。

圖2 pH對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響Figure 2 Effect of pH on the yield ofγ－CD

圖3 酶添加量對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響Figure 3 Effect of enzyme amound on the output ofγ－CD

2.4 淀粉種類對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

分別以玉米、木薯、馬鈴薯、蕉藕和甘薯淀粉為底物，在85℃烘干后配制成5%的淀粉液，在70℃充分糊化后，冷卻，加入甘草酸2%，在pH 8.0加入適量酶液，于60℃反應(yīng)12h。由圖4可知，馬鈴薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉和蕉藕淀粉生產(chǎn)γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量逐步升高，蕉藕淀粉和木薯淀粉的生產(chǎn)γ－環(huán)糊精的效果較佳，因此，蕉藕淀粉和木薯淀粉在生產(chǎn)γ－環(huán)糊精時是CGTase比較合適的底物。

圖4 淀粉種類對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響Figure 4 Effect of various starch on the yield ofγ－CD

2.5 甘草酸對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

據(jù)Sato等報道［17］，甘草酸用來有選擇的提高γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量，只有用在Bacillus ohbensis來源的CGTase反應(yīng)中，而用在Bacillus macerans和Bacillus circulans來源的CGTase中沒有效果，不能增加γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量。說明γ－環(huán)糊精與甘草酸形成的包合物抑制反向反應(yīng)取決于酶的來源。

為了確定甘草酸的作用，以加2%甘草酸和不加甘草酸為對照，在加酶量500U/g·淀粉、溫度60℃、pH 8.0、淀粉濃度5%、甘草酸2%，反應(yīng)從開始1h后分別取點進(jìn)行測定。由圖5可知，加了甘草酸的比不加甘草酸的對照組，γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量明顯增加，這說明甘草酸對來源于Bacillus alkalophilic的酶可以用來有選擇的提高γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量，當(dāng)隨著反應(yīng)時間的增加，γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量的也隨之增加，當(dāng)達(dá)到12h時，γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量達(dá)到最大值，然后隨著時間的增加，γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量又隨之降低。

圖5 反應(yīng)時間對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響Figure 5 Effect of time on the yield ofγ－CD

為了確定甘草酸的最佳添加量，以1%，1.5%，2%，2.5%，3%甘草酸進(jìn)行試驗，在加酶量500U/g·淀粉、溫度60℃、pH 8.0、淀粉濃度5%，反應(yīng)12h后進(jìn)行測定。由圖6可知，隨著甘草酸的增加，γ－環(huán)糊精產(chǎn)量也隨之增加，當(dāng)甘草酸的添加量達(dá)到2%后，即使甘草酸的增加到3%，γ－環(huán)糊精產(chǎn)量也不再增加，因此，甘草酸的最佳添加量為2%。

2.6 淀粉水解度DE值對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

將5%蕉藕淀粉用一定量的α－淀粉酶在95℃進(jìn)行水解，分別得到淀粉的 DE 值為 2.06，5.15，6.14，11.37，14.63，17.38，20.01，再在pH 8.0，溫度60℃，加酶量500U/g·淀粉，甘草酸2%的條件下，分別反應(yīng)12h后進(jìn)行測定。由圖7可知，DE值在6～11時，γ－環(huán)糊精和β－CD的產(chǎn)量較高。當(dāng)DE值大于11，γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量開始下降。

圖6 甘草酸對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響Figure 6 Effect of glycyrrhizin on the yield ofγ－CD

2.7 普魯藍(lán)酶對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量的影響

普魯藍(lán)酶是一種脫支酶，它作用于淀粉，能切斷支鏈淀粉分子中的a－1，6－葡萄糖苷鍵，提高淀粉分子中直鏈淀粉的比例［18］。因此，為了分析普魯藍(lán)酶對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量有多大影響，選擇10，20，40，80U/40mL 4種劑量的普魯藍(lán)酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為淀粉濃度5%，pH 8.0、糊化后加入普魯藍(lán)酶和CGTase在60℃反應(yīng)12h后進(jìn)行測定。由圖8可知，γ－CD的產(chǎn)量增加為5.3%，并且普魯藍(lán)酶超過40U時，γ－CD的產(chǎn)量都有所下降。說明普魯藍(lán)酶對γ－CD的產(chǎn)量增加作用有限。

圖7 DE對γ－環(huán)糊精產(chǎn)量值的影響Figure 7 Effect of glycyrrhizin on the yield ofγ－CD

圖8 普魯藍(lán)酶對γ－環(huán)糊精的影響Figure 8 Effect of Pullulanase on the yield ofγ－CD

3 結(jié)論

本試驗采用來源于嗜堿芽孢桿菌Bacillus alkalophilus12－7的CGTases合成的環(huán)糊精主要是β－環(huán)糊精，通過對其酶促反應(yīng)條件和相關(guān)因素進(jìn)行研究，獲得了CGTases生產(chǎn)γ－環(huán)糊精的最佳制備工藝條件：反應(yīng)體系的pH 8.0，溫度60℃，酶量500U/g·蕉藕淀粉，甘草酸濃度2%，淀粉的DE值6～11時，在此條件下能獲得較高產(chǎn)量的γ－環(huán)糊精；蕉藕淀粉和木薯淀粉在生產(chǎn)γ－環(huán)糊精時是CGTase比較合適的底物；普魯藍(lán)酶對γ－環(huán)糊精的產(chǎn)量有一定作用，但增加量有限。本試驗的不足之處是對γ－環(huán)糊精從反應(yīng)液中的分離提取沒有做進(jìn)一步的工作，這對γ－環(huán)糊精的推廣應(yīng)用有較大的限制作用。以后有待加強這方面的研究工作。

1 Szejtli J.Cyclodextrin Technology［M］.Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，the Nethertlands，1988：1～5.

2 Xinzhi C，Zhengyu J，F(xiàn)eng C，et al.Purification and properties of cyclodextrin glucanotransferase from an alkalophilicBacillus sp.7－12［J］.Journal of Food Biochemistry，2004，28（6）：463～475.

3 曹新志，金征宇.響應(yīng)曲面法在環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中的應(yīng)用［J］.鄭州工程學(xué)院學(xué)報，2004，25（1）：58～61

4 楊榮華，周凌霄，林家蓮.環(huán)糊精的開發(fā)現(xiàn)狀及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［J］.食品與機械，1999（3）：33～34

5 吳劍峰.環(huán)糊精及其衍生物在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2004，15（3）：181～182.

6 Rongnong F，Huwei L.High resolution gas chromatography and high resolution pyrolysis gas chromatography［M］.Beijing：Beijing Institute of Technology Press，1992：169～172.

7 楊國武，李皎，謝薇梅，等.γ－環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生菌32－3－10產(chǎn)酶條件及酶促反應(yīng)條件的研究［J］.工業(yè)微生物，2001（2）：24～26.

8 Kato T，Horikoshi K.A newγ－cyclodextrin forming enzyme produced by Bacillus subtilis no.313［J］.J.Jpn.Soc.Starch Sci.，1986（34）：137～143.

9 Masayasu T，Yoshionri N，Mikio Y.Biochemical and genetic analyses of a novelγ－cyclodextrin glucanotransferase from an alka－lophlic Bacillus clarkia 7364［J］.J.Biochem，2003，133：317～324.

10 曹新志，金征宇.環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶高產(chǎn)菌株的篩選［J］.中國糧油學(xué)報，2003，18（6）：53～55

11 潘學(xué)軍，劉會洲，賈光和，等.從甘草中提取甘草酸的不同提取方法的比較［J］.過程工程學(xué)報，2001，1（1）：104～105.

12 謝主蘭，吳雪輝.板栗深加工中淀粉的酶水解研究［J］.食品科學(xué)，2003，24（10）：63～66.

13 曹新志，金征宇.環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化及性質(zhì)［J］.食品科學(xué)，2004，25（4）：43～46

14 史血巖，邵青龍，陶丹妮，等.一種芐基取代的環(huán)糊精衍生物的合成及其氣相色譜性能研究［J］.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報，2001，22（7）：1 098～1 101.

15 朱海霞，石瑛，張度娜，等.3，5－二硝基水楊酸（DNS）法測定馬鈴薯還原糖的研究［J］.中國馬鈴薯，2005，19（3）：266～269.

16 姜文俠，孫武岳.還原糖和DE值的測定方法［J］.食品研究與開發(fā)，1997（2）：58～61.

17 Sato M，Yagi Y.Biotechnology of amylodextrin oligosaccharides［M］.Washington，DC：American Chemical Society，1991：125～137.

18 曹新志，金征宇.支鏈環(huán)糊精的研究進(jìn)展［J］.糧食與油脂，2004（2）：48～50.

Optimization on enzymatic reaction conditions ofγ－cyclomaltodextrin by CGTase

CAO Xin－zhi1LIU Fang1MING Hong－mei1JIN Zheng－yu2

（1.Applied Institute of Food and Biotechnology，Sichuan Science and Technology College，Zigong，Sichuan643000，China；2.Food School，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214036，China）

A strain ofBacillus alkalophilus12－7which could produce glucanotransferase （CGTase）forming γ－cyclomaltodextrin was screened.Cyclodextrins production technology conditions were studied，and we mainly discussed the influence of enzymatic reaction conditions onγ－cyclodextrins production by glucanotransferase.The results showed that：the enzymatic reaction conditions were pH 8.0，temperature 60℃，enzyme amount 500U/g starch，glycyrrhizic acid concentration 2%，DE 6～11，yield of CGTase was good，edible Canna Starch and tapioca starch were suitable substrate of CGTase in production ofγ－CD，Promozyme in increased the yield ofγ－CD was limited.

Bacillus alkalophilus；cyclomaltodextrin glucanotransferase；γ－cyclomaltodextrin

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.052

曹新志（1965－），男，四川理工學(xué)院教授，博士。E－mail：caoxinzhi＠163.com

2011－12－01