蛹蟲草菌的液態培養基優化

牛帥科楊自潔李 艷，2

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018）

蛹蟲草菌的液態培養基優化

牛帥科1楊自潔1李 艷1，2

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北 石家莊 050018）

采用響應面法優化蛹蟲草菌的液態培養基，以獲得最大菌體量為響應值，采用Plackett－Burman試驗篩選出主要影響因素為葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂。再利用最陡爬坡試驗確定響應區域的中心點。最后利用中心復合試驗確定最優的培養基配方為葡萄糖53.363 6g/L，蛋白胨26.720g/L，七水硫酸鎂2.195 2g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L。蛹蟲草菌的最終菌體總干重為3.91g/L，比優化前增加了2.48倍。

蛹蟲草菌；培養基；液態發酵

蛹蟲草菌，又稱北冬蟲夏草，是一種名貴的藥用真菌。蛹蟲草菌含有多種有效成分，包括核苷類化合物（又稱蟲草素）、蟲草多糖、蟲草酸、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）、維生素及微量元素等7大類具有生物活性和藥理作用的化合物［1］。這些有效成分可以增強人體免疫能力，并具有抗癌、抗病毒等功效［2］。目前市場上銷售的冬蟲夏草人工替代品主要是通過3類方法培育的蛹蟲草菌：① 用鮮或干蠶蛹體培植出的蛹與草為一體的“蛹體蟲草”；② 以大米、小麥等為主要原料，在固態人工合成培養基上培植出的“蟲草菌子實體”；③ 采用液體深層發酵法培養的蛹蟲草菌絲體。在藥化、藥理和臨床試驗［3］均證明它們的主要有效成分可替代天然的冬蟲夏草。對蛹蟲草菌進行液態發酵培養大量生產菌絲體，比固態培養蛹蟲草菌子實體具有周期短、可控性強、功能性有效成分含量高等優點，且利于大規模生產［4，5］。液態發酵培養蛹蟲草菌的生長受培養基組成的影響，培養基內碳源、氮源和無機鹽等各種物質的加量與配比，及其各種物質間的交互作用對菌體生長和得量都有直接的影響。本試驗利用響應面法，對液體培養蛹蟲草菌的培養基進行了優化，目的是獲得菌體最大量的培養基配方。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

蛹蟲草菌（cordyceps sinensis）KDLMH01：由本實驗室保藏；

出發菌株：衡水鹿鳴春蟲草科技開發有限公司。

1.1.2 試驗儀器與藥品

電熱鼓風干燥箱：101－0AB型，天津泰斯特儀器有限公司；

循環水式多用真空泵：SHB－III型，鄭州長城科工貿有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ－LS－50SII型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；

葡萄糖、蛋白胨等：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 培養基

斜面種子培養基：馬鈴薯瓊脂（PDA）培養基。

原始培養基組成：葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，七水硫酸鎂1g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，自然pH 值。

1.3 培養過程

1.3.1 菌種活化 將冰箱保存的斜面菌種劃線接入于固態PDA培養基平板中進行活化培養，25℃靜置培養48h。

1.3.2 種子培養 切取0.5cm2平板活化菌種接入原始種子培養基進行液態種子培養，25℃靜置培養3d。

對患者實施無陪護護理前、3個月后危險事件發生率以及焦慮情緒進行對比，其中焦慮情緒通過漢密爾頓焦慮量表（HAMA）給予評估，總分29分，分值越高表明焦慮情緒越嚴重。

1.3.3 響應面優化液態發酵培養 將種子培養液按照12.5μL/mL的接種量接種于響應面優化試驗設計的各個液態發酵培養基中進行發酵培養，25℃，自然pH值，靜置培養9d。

1.4 生物量檢測方法

蛹蟲草菌生長及生物量的檢測采用菌絲體干重法，即定時取樣，真空抽濾，90℃烘干2h稱重，以濾紙抽濾后和抽濾前的干重差值為菌絲體干重。

1.5 響應面試驗設計

1.5.1 主要影響因素的確定 設計Plackett－Burmen試驗，對4因素2水平進行考察。以原始培養基組成含量設為0，高水平編碼1，低水平編碼－1，用minitab軟件進行最終數據的處理。以0點的0.5倍為－1水平，0點的1.5倍為＋1水平，詳見表1。

表1 PB試驗設計的試驗因子和試驗水平Table 1 The experiment factor and the experiment level of PB experiment design /（g·L－1）

1.5.2 最陡爬坡試驗確定中心點 根據Plackett－Burmen試驗結果，決定爬坡的方向及步長，確定出中心復合試驗的中心點。

1.5.3 中心復合試驗 使用 Minitab軟件設計3因素3水平中心復合試驗。確定最優培養基配比。

1.5.4 驗證實驗 使用優化后的發酵培養基配方與原始培養基配方進行液態發酵對比試驗、接種量、培養溫度和時間等見1.3.3。以菌絲體干重為響應值。

2 結果與討論

2.1 主要影響因素的確定

按照Plackett－Burmen兩水平法設計次數為N＝4試驗，對葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀4個因素進行考察，響應值為菌絲體干重，目的是為了篩選出影響菌體生長的主要影響因素，Plackett－Burmen試驗設計及結果見表2。對Plackett－Burmen試驗結果分析見表3。

由表3可知，各因素的影響程度依次是A＞B＞C＞D，A和B的P值小于0.05，屬于顯著影響因素；決定系數R2＝92.55%，表示該試驗結果良好。最終確定顯著因子A、B、C 3個因素，即葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂進行最陡爬坡試驗。

表2 PB試驗設計及結果Table 2 Design and results for PB experiment

表3 PB試驗結果分析Table 3 The result analysis of PB experiment

2.2 中心點的確定

為了得到中心復合試驗的中心點，需要利用最陡爬坡試驗確定，根據Plackett－Burmen試驗結果可知葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂3個影響因素的T＞0，屬于正向影響，如果要提高響應值，則需要提高此三因素的濃度。初始濃度分別為20，5，0.5g/L。最陡爬坡試驗設計及結果見表4。

由表4可知，前期隨著葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂濃度的增加，菌體量有所增加，說明葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂的增加對菌體的增量有明顯的正影響。到第7組樣開始降低，原因可能是高含量的葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂使培養基的滲透壓提高，超過了該菌的耐滲透壓極限，導致菌體量下降。第6號樣是爬坡試驗的頂點，即為中心復合試驗的中心點，葡萄糖（A）、蛋白胨 （B）、七水硫酸鎂（C）的最優濃度分別為60，20，2g/L。由此點進行中心復合試驗。

表4 爬坡試驗設計及結果Table 4 Design and data from the steepest ascent experiment

2.3 中心復合試驗

以Plackett－Burmen試驗得到的 A（葡萄糖）、B（蛋白胨）、C（七水硫酸鎂）為主要影響因素，爬坡試驗得到的中心點，進行中心復合試驗。設計A、B、C的步長分別為10，4，0.5g/L。5個水平分別為－1.68，－1，0，1，1.68。中心復合試驗設計及結果見表5，分析結果見表6。

表5 中心復合試驗設計及結果Table 5 Design and results from central composite experiment

表6 中心復合試驗結果分析+Table 6 Result analysis of composite experiment

該中心復合試驗中心點針對3個變量5個水平總共做了18組試驗，由表6可知，t值表示各因素的顯著性影響，正負表示的是各個因素的影響方向。而P值大小也是作為檢驗各個因素的顯著性影響大小的標尺，P值越低則表示其影響越顯著，若P值小于5%則認定為顯著影響因素［6，7］。可以看出表6中的因素：A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC、BC，其中除C、BC以外，包含7個顯著項。基于表6中各個因素的系數可以創建二次回歸多項式方程：

R2的大小可以解釋此模型是否擬合試驗結果，本試驗模型決定系數為R2＝95.2%，此決定系數是通過試驗中單因素和各個因素間交互作用的結果來說明此響應面結果具有多大的可變性。校正后的R2為89.8%，說明該模型與試驗結果擬合度較好，試驗誤差較小，所以模型是合適的，可以將模型用于分析蛹蟲草菌培養基的優化［8，9］。

2.4 響應面分析與最優培養基配方的確定

根據表5中的數據，應用Minitab系統軟件繪制響應曲面圖進行嶺脊分析［10］，應用 Minitab軟件繪制響應曲面圖，可以直觀的反映出各因素對響應值影響的變化趨勢，每張圖表示固定其中一個因素，另外兩個因素之間的交互作用。各個因素間的嶺脊分析見圖1～3。

由圖1可知，葡萄糖和蛋白胨作為變量，七水硫酸鎂作為固定量，可以從圖中直觀的看到當葡萄糖量在0附近時，蛋白胨在0至1內此響應面達到最高點。圖1～3皆表明葡萄糖、蛋白胨、七水硫酸鎂的濃度在所選因素水平范圍內，均有最大響應值出現，呈現較好的結果。

利用Minitab軟件優化器繪制響應面優化圖得到最優結果：A：0.764 5、B：1.681 8、C：0.390 7，換算為實際含量：葡萄糖為53.363 6g/L，蛋白胨為26.720g/L，七水硫酸鎂為2.195 2g/L時是響應面的頂點，為最優結果。得到的理論菌體干重為4.157 5g/L。按照此配方最終得出實際菌體干重為3.910 0g/L接近理論值，優化后的培養基理論上與未優化前的1.517g/L相比可以提高2.74倍的產量，實際提高了2.48倍。

圖1 葡萄糖濃度與蛋白胨濃度的響應面立體分析Figure 1 The Response surface analysis of glucose’s concentration and peptone’s concentration

圖3 蛋白胨濃度與七水硫酸鎂濃度的響應面立體分析Figure 3 The Response surface analysis of MgSO4·7H2O’s concentration and peptone’s concentration

3 結論

蛹蟲草作為藥品、保健品、食品添加劑等物質，具有較高的經濟效益和開發前景，但天然的蛹蟲草來源稀少，并且天然蟲草菌中的核苷類物質與人工養殖相比較少［11］，這就使得人工培育特別是液態深層培養蛹蟲草成為熱點［12］。通過對蛹蟲草菌液態培養基進行響應面優化研究，最終確定了最佳培養基比例為葡萄糖53.363 6g/L，蛋白胨26.72g/L，七水硫酸鎂2.195 2g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L。經過優化，發酵產量與優化前相比菌體量提高了2.48倍，且此試驗重現性較高，為大規模液態發酵生產蛹蟲草奠定了基礎。

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Optimization ofcordyceps sin en sisliquid medium by response surface method

NIU Shuai－ke1YANG Zi－jie1LI Yan1，2

（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，
Shijiazhuang，Hebei050018，China；2.R＆D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province，Shijiazhuang，Hebei050018，China）

This experiment used the response method to optimize the liquid medium ofcordyceps sinensis，inorder to get the biggest mycelia weight.The Plackett－Burman experiment screened out the main influence factors：glucose，peptone and magnesium sulfate.Then the path of the steepest ascent was utilized to approach the point of the optimal region.At last，the central composite experiment was done to determine the optimal formula of the medium：glucose 53.363 6g/L，peptone 26.720g/L，MgSO4·7H2O 2.195 2g/L，KH2PO40.5g/L.And the dry weight ofcordyceps sinensiswas 3.91g/L，to compare with the initial increased 2.48times.

cordyceps sinensis；medium；liquid fermentation

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.054

河北省石家莊市科技支撐計劃（編號：10117901A）

牛帥科（1987－），男，河北科技大學在讀碩士研究生。E－mail：nskice＠126.com

李艷

2011－12－01