δ阿片受體激動劑DADLE對膿毒癥大鼠血清HMGB1表達的影響及其作用的研究

[摘要] 目的 觀察δ阿片受體激動劑DADLE對膿毒癥大鼠血清HMGB1水平及器官功能的影響。 方法 96只SD大鼠分為假手術組（SO）、膿毒癥組（SEP）、DADLE組[制模后腹腔內注射DADLE（5 mg/kg）]，各32只。盲腸結扎穿孔（CLP）建立膿毒癥模型，制模后6、12、18、24 h各取8只處死取材。ELISA法檢測血清HMGB1水平及24 h ALT、AST、BUN、Cr、CK及PaO2的變化。 結果 HMGB1水平在SEP組、DADLE組12 h 18 h及24 h均較SO組高（P < 0.05），DADLE組則顯著低于SEP組（P < 0.05）。24 h時DADLE組血ALT、AST、BUN、Cr、CK均較SEP組明顯改善，PaO2明顯升高（P < 0.05），且各指標變化與HMGB1有顯著相關性（P < 0.05）。 結論DADLE抑制HMGB1釋放，對膿毒癥大鼠重要臟器功能有保護作用。

[關鍵詞] DADLE；膿毒癥；高遷移率族蛋白1；器官功能

[中圖分類號] R459.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）30-0004-02

Study on the effect of delta-opioid receptor agonist on serum HMGB1 in sepsis rat

CHAI Zhenzhong TANG Chengwu FENG Wenming BAO Ying ZHU Ming

Department of Hepatobiliary Surgery and Molecular Surgery，the First People’s Hospital Affiliated to Huzhou University Medical College， Huzhou 313000，China

[Abstract] Objective To observe the effects of delta-opioid receptor agonist（DADLE） treatment on the expression of serum HMGB1 and multiple organ function in sepsis rat. Methods A total of 96 SD rats were randomly divided into sham operated group（SO），septic group（SEP） and DADLE group（DADLE）. Septic model was produced by cecel ligation and puncture（CLP）. In SO group，the abdomen was opened without any other treatment. In DADLE group，DADLE was administered at a dose of 5 mL/kg by intra-peritoneal injection after CLP. Rats were sacrificed at 6 h，12 h，18 h and 24 h after CLP. HMGB1 level was determined by ELISA，and organ functional parameters were collected. Results Compared with sham operation group，the serum HMGB1 increased in DADLE treatment group and sepsis group（P < 0.05） at 12 h， 18 h and 24 h after CLP，the result in DADLE treatment markedly decreased than that in sepsis group（P < 0.05）. Compared with sepsis group，the serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），blood urea nitrogen（BUN），creatinine（Cr） and creatine kinase（CK） levels were markedly decreased in DADLE treatment group（P < 0.05），and PaO2 were also significantly elevated（P < 0.05）. The serum HMGB1 was correlate with the changes of organ functional parameters in the sepsis group at 24 h post-operation. Conclusion DADLE could inhibit HMGB1 expression and prevent the development of multiple organ dysfunction secondary to sepsis in rat.

[Key words] DADLE； Sepsis； High-mobility group box 1 protein； Organ function

膿毒癥（sepsis）是創傷、感染、大手術及休克等臨床急危重患者的嚴重并發癥之一，也是多器官功能障礙綜合征（MODS）的重要誘因之一。國外流行病學調查顯示，全球每年約有超過1 800萬嚴重膿毒癥病例，且患者數目仍以每年1.5%速度遞增[1]。膿毒癥時多種炎癥因子參與其病理過程，但具體機制有待進一步研究，并且缺乏有效的治療措施。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）作為膿毒癥潛在的晚期炎癥因子，是膿毒癥致死效應過程中重要的炎性介質之一，通過干預HMGB1可以有效地防止膿毒癥及MODS的發生和進展[2]。我們通過對人工合成的非選擇性δ阿片受體激動劑DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）的研究發現其能夠明顯降低膿毒癥死亡率[3]，但其機制尚不清楚。本研究采用CLP法建立大鼠膿毒癥模型，觀察DADLE對膿毒癥大鼠血清HMGB1表達水平的干預作用，以及其對大鼠多器官功能的影響，為膿毒癥的救治提供新的理論依據。

1材料與方法

1.1材料

δ阿片受體激動劑購自美國Sigma公司，分子式為C29H39N5O7。大鼠高遷移率族蛋白B1的ELISA定量檢測試劑盒購自日本Shino-Test公司。

1.2 動物的分組及膿毒癥模型的建立

取清潔級健康雄性SD大鼠96只，體重250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，將其隨機分為三組：假手術組（SO組）、膿毒癥組（SEP組）及DADLE治療組，32只一組，通過改良盲腸結扎穿孔法（CLP）建立膿毒癥模型，按照Wichterman等[4]的改良盲腸結扎穿孔法（CLP），將盲腸穿孔數增至4個，假手術組開腹后不施行CLP，余操作同SEP組，DADLE治療組在制模后立即腹腔內注射濃度為0.5 mg/mL的DADLE，按5 mL/kg體重。CLP后分別在6 h、12 h、18 h及24 h時每組斷頸處死8只大鼠，取血通過ELISA法測定血清HMGB1濃度，并于24 h留取動脈血標本檢測血清ALT、AST、BUN、Cr、CK及PaO2的水平。

1.3 指標的檢測及方法

1.3.1 血清HMGB1的檢測 ELISA法測定血清HMGB1濃度。

1.3.2 血清各生化指標檢測 血清ALT、AST、BUN、Cr及CK的水平采用美國杜邦Dade Behring Rxl生化分析儀測定。

1.3.3 動脈血氣分析 采用美國實驗儀器公司 GEM 3000血氣分析儀測定。

1.4 統計學方法

所有數據統計采用SPSS 10.0軟件統計處理。結果以均數±標準差（x±s）表示，通過方差分析進行多組間比較，組間兩兩比較用q檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清HMGB1的變化及DADLE的干預作用

如表1所示，術后6 h SEP和DADLE治療組血清HMGB1水平開始升高，但三組間差異無明顯統計學意義（P > 0.05）；12 h SEP組和DADLE組血清HMGB1水平較SO組均顯著升高（P < 0.05），且DADLE組顯著低于SEP組（P < 0.05）；SEP組和DADLE組血清HMGB1水平在18 h時達到最高，且DADLE組明顯低于SEP組（P < 0.05）；24 h時，SEP組及DADLE組的血清HMGB1水平較18 h時有所下降，但此時DADLE組HMGB1水平仍顯著低于SEP組（P <0.05）。

2.2 24 h血清各臟器生化指標的變化及DADLE干預作用

見表2所示，與SO組比較，DADLE組和SEP組ALT、AST、BUN、Cr、CK水平均顯著升高（P < 0.05），PaO2均顯著下降（P < 0.05）；與SEP組相同時點比較，各DADLE治療組24 h血清ALT、AST、BUN、Cr、CK水平均顯著下降（P < 0.05），而PaO2則顯著升高（P < 0.05）。

2.3 膿毒癥組24 h血清HMGB1與各臟器生化指標變化的相關性分析

血清HMGB1與血清ALT、AST、BUN、Cr、CK均呈顯著正相關（P < 0.05），與PaO2則呈顯著負相關（P < 0.05）。

3 討論

膿毒癥是感染、創傷等各種原因引起的全身炎癥反應綜合征。膿毒癥伴器官功能障礙屬于嚴重膿毒癥，有高達50%的病死率[5]。通過盲腸結扎穿孔法建立嚙齒類動物標準的膿毒癥模型[6]，導致嚴重腹膜炎及致死性膿毒癥綜合征時，相較于TNF-α、IL-1等早期炎性細胞介質，HMGB1出現晚，持續時間長。HMGB1血清水平在CLP后24～48 h明顯增加，因其分泌特點，HMGB1被稱為晚期炎癥介質[7]。

本研究顯示，SEP組12 h、18 h及24 h時血清HMGB1水平均較同時相SO組顯著升高（P均 < 0.05），通過相關性分析表明，血清HMGB1與血清ALT、AST、BUN、Cr、CK呈顯著正相關（P均 < 0.05），與PaO2呈顯著負相關（P < 0.05），提示血清HMGB1參與了膿毒癥機體損傷的發生、發展過程，血清HMGB1水平的升高與膿毒癥大鼠多臟器功能不全的發生有關。有資料顯示，通過使用抗HMGB1抗體能夠顯著降低膿毒癥大鼠的死亡率，即使在膿毒癥發生24 h后，其仍有明顯的保護作用，因此相較于早期炎癥因子，HMGB1出現晚、持續時間更長，能給膿毒癥的治療提供更廣的時間窗[8]。DADLE作為人工合成的非選擇性δ阿片受體激動劑，有實驗表明其能改善組織缺氧狀態時的能量代謝[9]。盡管DADLE已被應用到針對膿毒癥的研究當中，但其對膿毒癥組織損害的影響及機制尚不明了。本研究采用CLP法建立膿毒癥大鼠模型，觀察了SEP組、DADLE治療組各臟器功能以及血清HMGB1的變化。結果提示，與SEP組相同時間點比較，DADLE治療組24 h肝、腎、心、肺各器官功能指標血清ALT、AST、BUN、Cr、CK水平均顯著下降，PaO2則均明顯升高，提示DADLE對膿毒癥大鼠重要臟器功能具有一定的保護作用。通過對各組血清HMGB1水平變化的觀察，發現DADLE處理組HMGB1水平較同時相SEP組均有顯著下降，且與肝、腎、心、肺器官功能指標呈顯著相關。因此本研究提示，DADLE通過抑制血清HMGB1的表達，達到減輕膿毒癥時的炎癥反應，發揮其對臟器功能的保護作用。

綜上所述，膿毒癥時大鼠血清HMGB1顯著增高，其升高與臟器功能損害存在相關性，而DADLE通過抑制血清HMGB1的升高而起到治療作用，從而為膿毒癥的治療及臨床應用提供新的方向。

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（收稿日期：2012-05-29）