難治性癲癇動物模型研究的新進展

[摘要] 難治性癲癇是最棘手的臨床問題之一，其病因至今未明。由于人體腦組織難以獲取等限制，難治性癲癇發生機制的研究需依賴動物模型。本文對不同難治性癲癇動物模型的制作方法、表現和機制等方面作綜述。

[關鍵詞] 難治性癲癇；動物模型；進展

[中圖分類號] R742.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）30-0011-02

Recent progress in the study of animal model of refractory epilepsy

WANG Guangxin

Medical Institute of Paediatrics， Qilu Children’s Hospital of Shandong University， Jinan 250022， China

[Abstract] Refractory epilepsy is one of the most thorny subject and its etiology is unkown. Attempts to study in vivo are harmpered by the lack of suitable brain tissue from patients with refractory epilepsy or controls. Nevertheless， an animal model would be a valuble tool to study mechanisms of refractory epilepsy and to develop more effective treatment approach. This paper reviews establishment， features and mechanism of animal model of refractory epilepsy.

[Key words] Refractory epilepsy； Animal model； Progress

癲癇（epilepsy）是最常見的神經系統疾病之一，由大腦神經元反復發作的異常放電而引起的、以中樞神經系統功能失常為特征的慢性腦部疾病[1]。全球約0.5%～1%的人口受到該病累及[2]，其中70%～80%患者經系統應用抗癲癇藥治療可獲得長期緩解，其余20%～30%患者的發作不能得到有效控制，成為難治性癲癇（refractory epilepsy）[1]。難治性癲癇是最棘手的臨床問題之一，因為長期反復發作，不僅使患者遭受到軀體痛苦，而且在一定程度上可導致患者心理障礙及引起一系列社會問題[3]，因此，難治性癲癇是目前癲癇研究的難點和重點。由于難治性癲癇患者的腦組織較難獲取，即使獲取了少量患者的標本，也很難獲取正常對照者的腦組織，因此在人體研究難治性癲癇的形成機制難以開展。動物模型可篩選出難治性癲癇和藥物有效癲癇，克服了人體研究的缺陷，可用于難治性癲癇發生機制的研究，進而尋找到更加有效的治療方法[4]。本文對難治性癲癇動物模型研究的新進展綜述如下。

1 難治性癲癇動物模型的選擇標準及評定

難治性癲癇又稱耐藥性癲癇，其內涵為發作不能得到有效控制的癲癇。但是，難治性癲癇的定義至今尚未統一，Leppik認為難治性癲癇是指在準確診斷及細致監測下采用抗癲癇藥1年后發作仍不能得到完全控制，但多數學者則認為至少2種及以上抗癲癇藥連續治療2年才能判斷是否為難治性癲癇[5]。癲癇動物模型的建立將為探討難治性癲癇的發病機制、篩選鑒定新的抗癲癇藥發揮重要作用。難治性癲癇動物模型的選擇標準如下：①發作類型及表現與人類難治性癲癇相似；②癲癇發作與自發腦電圖活動一致，從而利于評估抗癲癇藥對行為和腦電圖的影響；③經典抗癲癇藥不能有效阻止癲癇發作；④模型動物體內抗癲癇藥的濃度在有效范圍時，能夠長期存活。

難治性癲癇動物模型制作時，動物癇性發作的嚴重程度按照Racine分級分為五級：Ⅰ級表現為閉眼、胡須動、面部抽搐；Ⅱ級為點頭、咀嚼伴面部抽搐；Ⅲ級為一側前肢抬起、陣攣；Ⅳ級表現站立常伴兩側前肢陣攣；Ⅴ級表現站立、扭轉并伴有跌倒[6]。出現Ⅳ級及以上癥狀時說明癲癇模型建立成功。

2 遺傳性癲癇動物模型

有些動物先天具有癲癇的易感性，因此可以成為遺傳性癲癇模型。作為狗類最常見的神經系統疾病[7]，狗癲癇發作的類型、腦電圖改變與人類癲癇相似，且難治性癲癇狗比藥物有效癲癇狗的發作頻率更高，病情更嚴重，因此癲癇狗是一種比較適合的難治性癲癇動物模型。Jambroszyk等以此種模型開展難治性癲癇機制的研究，結果發現難治性癲癇狗大腦毛細血管內皮細胞P-糖蛋白表達上調，與人類難治性癲癇相似[8，9]。癲癇狗也可用于新的抗癲癇藥的療效評估，另外治療方面，Kluger等認為苯巴比妥合并溴化鉀治療難治性癲癇狗能夠取得較好效果[10]，是否可推廣用于臨床，有待進一步驗證。除癲癇狗外，其他遺傳性癲癇模型，如聲源性敏感致癲癇大、小鼠，光敏致癲癇狒狒，均屬反射性癲癇，而非自發癲癇模型，且容易被抗癲癇藥控制，不宜作為難治性癲癇動物模型。另外，轉入癲癇基因或敲除相關基因也可以制作先天性癲癇動物模型，如與動作電位形成有關的鈉離子1.1通道α亞單位基因的突變已用于制作難治性癲癇小鼠[11]。由于轉入特定基因或敲除基因所導致細胞、分子異常便于界定，因此可以探討這些過程在難治性癲癇的形成過程中是否為關鍵因素。

3 難治性癲癇化學模型

化學性致癇劑如海人酸、匹魯卡品等可引起動物癇性發作，可制作化學性癲癇模型，常用的有以下幾種模型。

3.1 馬錢子堿或N-甲基-D，L-天門冬氨酸（NMDLA）/N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）誘發癲癇模型

作用于中樞神經系統興奮性/抑制性氨基酸的化學致癲劑較多，其中馬錢子堿通過阻斷甘氨酸受體誘導全面強直發作，NMDLA通過激活谷氨酸受體NMDA亞型而誘導全面強直-陣攣發作，NMDA則直接增強興奮性氨基酸的功能而誘導癲癇發作。馬錢子堿和NMDLA/NMDA誘導的癲癇模型對大部分典型抗癲癇藥不敏感，故理論上可作為難治性癲癇動物模型，但是，臨床研究發現NMDLA/NMDA拮抗劑不能有效控制此類癲癇發作，對人類難治性癲癇也無效。提示難治性癲癇與興奮性/抑制性氨基酸的相關性較小，故這種模型不適合用于難治性癲癇發生機制的研究。

3.2 鋰-匹魯卡品模型

匹魯卡品為膽堿激動劑，可引起部分發作繼發全面發作，但是，該模型對傳統抗癲癇藥如苯巴比妥、安定敏感，給耐藥篩選帶來了困難。另外，在注射匹魯卡品前應注意給予甲基莨菪堿（1 mg/kg）注射以緩解匹魯卡品的外周膽堿能副作用[2]。

3.3 海人酸模型

海人酸是谷氨酸的類似物，其中樞神經興奮性比谷氨酸強30～100倍[12]。苯二氮■類及三甲雙酮對該模型療效好，但苯妥英、卡馬西平及丙戊酸的效果較差，故進行耐藥篩選時，需要選擇2種抗癲癇藥進行篩選。海人酸所致癇性發作的類型為復雜部分性發作，給藥方法分為局部用藥（如腦室注射）和全身用藥（如腹腔注射）。由于Wistar大鼠對海人酸的敏感性高于SD大鼠，故應選用Wistar大鼠建立該模型[13]。

4 難治性癲癇電點燃模型

電刺激動物大腦的許多部位，如杏仁核、海馬、前新皮質及隔區等都可引起癇性發作，但杏仁核是最容易引起點燃的部位[13]。杏仁核電點燃模型制作時，首先將大鼠麻醉固定在腦立體定位儀上，確定大鼠杏仁核位置，然后用注射針頭穿透骨面，插入直徑為0.25 mm的絕緣雙極電極，尖端分開約0.25 mm，將電極用牙托粉及502膠水固定在顱骨表面，縫合頭皮。術后10 d開始點燃實驗[14]。采用電子刺激器輸出周期1 s，波寬1 ms，頻率50 Hz的恒流電脈沖，生物機能實驗記錄儀記錄大鼠電活動，刺激強度由20 μA開始，每次增加20%，刺激間隔1 min，直至出現3 s或3 s以上的皮層電流即腦電圖上出現棘尖或棘慢波，此時電流強度即為后放電閾值（ADT）。ADT確定5 min后給大鼠閾上刺激，雙相方波，刺激參數：強度400 μA，波寬1 ms，頻率60 Hz，持續時間1 s，刺激間隔時間7 min，直至出現Racine Ⅳ～Ⅴ級行為，即點燃，之后每天如此。點燃動物連續出現10次大發作后24 h測定點燃后ADT。對照大鼠ADT確定后24 h，實驗大鼠局部或全身給予抗癲癇藥，于最后一次用藥后測定ADT，此為用藥后ADT值。當與對照ADT比較，給藥后ADT增加20%為藥物有效癲癇；與對照ADT比較，給藥后ADT不增加或增加<20%為難治性癲癇。杏仁核電點燃模型的發作類型為復雜局灶發作繼發全面發作，已廣泛用于難治性癲癇發生機制的研究及治療方案的篩選[15]。

5 動物難治性癲癇模型的致癇機制

導致模型動物癲癇發作的機制主要有以下幾個方面：①興奮性升高：神經系統興奮性神經遞質釋放增加或功能上調，均可導致大腦興奮性升高，達到一定閾值后出現癲癇發作，如NMDLA/NMDA癲癇模型。②抑制性減弱：動物腦內抑制性神經遞質耗竭或功能減弱，可引起興奮性閾值下降，引發癲癇發作，如馬錢子堿通過阻斷抑制性神經遞質甘氨酸的受體而誘導全面癲癇發作；反復電刺激可使腦內去甲腎上腺素耗盡，成為杏仁核電點燃的致癇機制之一。③離子平衡失調：與動作電位發生相關的離子濃度失衡后，引起神經元動作電位閾值下降，出現神經元異常放電。④回返性興奮性環路形成：苔蘚纖維發芽是癲癇動物海馬的病理改變之一，其芽生側枝會回返進入大腦皮質顆粒層支配顆粒細胞，形成回返性興奮性環路，使癇性放電和癇性行為逐漸強化，最后出現癲癇大發作。如急性杏仁核點燃模型動物大腦已證實有苔蘚纖維發芽[16]，可能是該類模型的致癇機制之一。

總之，目前大多數研究構建的難治性癲癇動物模型與人類癲癇的癥狀、腦電圖改變相似，為難治性癲癇發生機制研究及新的抗癲癇藥評價和篩選提供了必要的工具。這些模型中以杏仁核電點燃模型和海人酸模型應用最為廣泛，其中前者具有較好的穩定性，易于量化，但該模型制作技術要求較高，制作過程繁瑣。而海人酸模型制作簡單，但對苯巴比妥、安定治療的反應較好，為難治性癲癇的篩查帶來一定限制。

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（收稿日期：2012-09-18）