吲哚在酪氨酸激酶抑制劑中的藥效團作用及合成方法

　　摘 要： 酪氨酸激酶抑制劑是一類能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。該類化合物大多作為三磷酸腺苷與酪氨酸激酶結合的競爭性抑制劑，阻斷酪氨酸激酶的活性，抑制細胞增殖。目前已有數種酪氨酸激酶抑制劑類抗腫瘤藥物在臨床上使用，治療效果明顯。本組致力于研究新一代的血管內皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑——貝雷文尼及其衍生物，本文主要研究貝雷文尼結構上重要的吲哚類藥效團及其合成方法。
　　關鍵詞： 酪氨酸激酶抑制劑 血管內皮生長因子受體 貝雷文尼 吲哚藥效團 化學合成方法
　　一、前言
　　21世紀，隨著科學技術的不斷發展，人類已經戰勝了一些以往難以治愈的疾病。但是，被稱為“世紀之魔”的癌癥，已經成為全球范圍內的常見病和多發病［１］，其死亡率之高，使其成為繼心腦血管疾病之后的又一類殺手。癌癥（Cancer），亦稱惡性腫瘤（malignant neoplasm），為由控制細胞生長增殖機制失常而引起的疾病。癌細胞除了生長失控之外，還會局部侵入周遭正常組織，甚至經由體內循環系統或淋巴系統轉移到身體其他部分。
　　衛生部《中國衛生統計提要》的數字顯示，2003年以來，癌癥連續在城市居民死因中位居首位，是嚴重危害居民健康和生命的疾病。自2006年6月起，衛生部和科技部聯合組織了第三次全國死因回顧抽樣調查。20世紀70年代，我國每年死于癌癥的人口約70萬。20世紀90年代，我國每年死于癌癥的人口約為117萬。21世紀初，我國每年死于癌癥的人口約為150萬。如不加以控制，中國癌癥死亡人數在今后20年中就將超過400萬，而癌癥患者總數將達660萬。
　　隨著癌癥在全球范圍內的肆虐，治療方法也在不斷更新，其中包括外科腫瘤學的治療、放射腫瘤學的治療、癌癥化療、癌癥的化學預防、大劑量化療、癌癥免疫治療和綜合治療等。其中，癌癥的治療方法一直是以外科手術、放射治療、化學療法為主的。藥物治療因其治療范圍有限——大部分癌癥是無法用藥物來治療的，只有有限的幾種可以使用，效果沒有一線療法好，所以一直處于輔助的治療地位。但是，從癌癥產生的那一天起，人類就沒有放棄過使用藥物治愈癌癥的希望，但因為科學傳統技術的制約問題，一直沒有長足的進步。隨著近代生命科學和合成化學的發展，出現了一批有代表性的常用抗腫瘤藥，其中包括烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、鉑類配合物、植物來源的抗腫瘤藥物等，多數是現今臨床正在被使用的品種。傳統的抗癌藥也多是細胞毒藥物，不僅對癌細胞有殺傷作用，而且對正常的人體組織細胞有極大的破壞作用，產生很大的副作用，患者生活質量明顯下降，人類對靶向給藥的抗癌藥有著急切的需求。
　　酪氨酸激酶抑制劑為一類能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。酪氨酸激酶抑制劑可作為三磷酸腺苷（ATP）與酪氨酸激酶結合的競爭性抑制劑，也可作為酪氨酸的類似物，阻斷酪氨酸激酶的活性，抑制細胞增殖，已經開發為數種抗腫瘤藥物。
　　二、文獻綜述
　　（一）酪氨酸激酶抑制劑
　　現在研究較多的蛋白激酶抑制劑包括表皮生長因子受體酪氨酸激酶、血管內皮生長因子受體抑制劑等。下面我們以表皮生長因子受體酪氨酸激酶（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）為例進行綜述。
　　EGFR是原癌基因c-erbB1的表達產物，是表皮生長因子受體（HER）的家族成員之一。該家族包括HER1（erbB1，EGFR），HER2（erbB2，NEU），HER3（erbB3）及HER4（erbB4）。HER家族在細胞生理過程中發揮重要的調節作用。
　　EGFR廣泛分布于哺乳動物上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞、角質細胞等細胞表面，EGFR信號通路對細胞的生長、增殖和分化等生理過程發揮重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失、其相關信號通路中關鍵因子的活性或細胞定位異常，均會引起腫瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的發生。
　　EGFR是上皮生長因子（EGF）細胞增殖和信號傳導的受體。EGFR屬于ErbB受體家族的一種，該家族包括EGFR（ErbB-1），HER2/c-neu（ErbB-2），Her3（ErbB-3）和Her 4（ErbB-4）。EGFR也被稱作HER1，ErbB1，突變或過表達一般會引發腫瘤。EGFR是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，細胞膜貫通，分子量170Da。
　　EGFR位于細胞膜表面，靠與配體結合來激活，包括EGF和TGFα。激活后，EGFR由單體轉化為二聚體，盡管也有證據表明，但激活前存在二聚體。EGFR還可能和ErbB受體家族的其他成員聚合來激活，例如ErbB2/Her2/neu。
　　EGFR二聚后可以激活它位于細胞內的激酶通路，包括Y992，Y1045，Y1068，Y1148 and Y1173等激活位點。這個自磷酸化可以引導下游的磷酸化，包括MPAK，Akt和JNK通路，誘導細胞增殖，受體激活對于皮膚的免疫來說很重要。
　　研究表明在許多實體腫瘤中存在EGFR的高表達或異常表達。EGFR與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關，其可能機制有：EGFR的高表達引起下游信號傳導的增強；突變型EGFR受體或配體表達的增加導致EGFR的持續活化；自分泌環的作用增強；受體下調機制的破壞；異常信號傳導通路的激活，等等。EGFR的過表達在惡性腫瘤的演進中起重要作用，膠質細胞、腎癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等組織中都有EGFR的過表達。對膠質細胞瘤的研究發現EGFR的高表達主要與其基因擴增有關。但有時EGFR表達水平的調節異常也存在于翻譯及翻譯后。EGFR在腫瘤中的高表達還可能與活化后降解減少有關，一些研究指出c-Src可通過抑制受體泛素化和內吞作用而上調EGFR水平。許多腫瘤中有突變型EGFR存在，現已發現許多種EGFR突變型。突變型EGFR的作用可能包括：具有配體非依賴型受體的細胞持續活化；由于EGFR的某些結構域缺失而導致受體下調機制的破壞、異常信號傳導通路的激活、細胞凋亡的抑制等。突變體的產生是由于EGFR基因的缺失、突變和重排。EGFR的配體對細胞內信號傳導有很大影響。EGFR的配體通過自分泌形式激活EGFR促進細胞增殖，它們的共表達往往預示腫瘤預后不良。例如，在乳腺浸潤性導管癌的研究中發現，TGFα與EGFR共表達，且這種共表達與病人的生存率顯著相關。Kopp等人對結/直腸癌的研究表明腫瘤的自分泌生長是EGFR的過表達及其配體表達共同作用的結果。
　　此外，對EGFR與腫瘤的血管生成、高侵襲性及轉移關系的研究發現EGFR可以通過Ang-1及VEGF等因子水平的調節而影響腫瘤血管生成。
　　在配體與表皮生長因子受體（EGFR）結合后，受體發生了二聚作用，二聚作用既包括兩個同種受體分子的結合（同源性二聚作用），又包括人類EGF相關性受體（HER）酪氨酸激酶家族中的不同成員的結合（異源性二聚作用）。二聚作用后是酪氨酸殘基的自磷酸化作用。這些磷酸化的殘基是募集適配蛋白和額外的酪氨酸激酶底物的結合位點。蛋白質在激活的受體復合物中相互作用刺激ras蛋白，引起磷酸化級聯反應的發生和絲裂原激活蛋白（MAP）激酶的激活，或者轉錄信號傳導和激活、磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K）-Akt和應激活化蛋白激酶（SAPK）信號傳導通路將被激活。這些信號通路依次觸發基因轉錄，同時控制細胞增生、分化和生存的通路被激活。EGFR介導信號通路的特異性和強度取決于激活蛋白的性質和四種EGFR家族成員的水平。與HER2結合的配體不詳，但當HER2和EGFR共表達時，前者經常與配體激活的后者結合形成二聚體。這種異源性二聚體與EGFR同源性二聚體相比，往往具有更高的再利用率、穩定性和傳導信號的能力。EGFR也能與HER3和HER4發生二聚作用，其產物具有更高的持久性和更強的PI3K活性。EGFR信號傳導通路一旦配體結合的EGFR被內吞入細胞，信號就將終止，受體將被降解或再循環到細胞膜表面，這取決于配體的性質。例如，EGF結合的受體將被降解，而TGF-α結合的受體則進入再循環。不同的生長因子會影響EGFR信號通路的數量和持續時間。EGFR信號通路有多重的生物學作用。例如，Ras-MAPK信號轉導通路刺激細胞的分裂和遷徙。EGFR也是多種受體通路的重要介體，起到信號會聚點的作用，能夠將信號整合和多樣化。例如，在應激、膜解聚作用和一些非生理性刺激物（包括氧化劑、放射線和烷化劑）的反應中，反向激活能誘導EGFR酪氨酸激酶的磷酸化并隨后發生信號的轉導。EGFR家族的成員在正常發育中起了重要的作用，但在人類腫瘤中經常過度表達并失去控制。
　　（二）吲哚衍生物
　　吲哚環化合物是重要的有機原料和化工產品，近年來吸引了越來越多的化學家的關注。吲哚環化合物不僅可以合成染料、制備香料，還可以用作植物生長素、飼料添加劑，而且可以治療心血管病、糖尿病及肺癌等多種疾病，因此它在工業、農業及醫藥等領域中有著十分廣泛的重要用途。隨著人們對吲哚環化合物用Z5/3rXQ0pU3ZNG9mgar0ww==途認識的深入，對吲哚環化合物合成方法的研究也越來越多，現在每年都有不少關于這方面的報道。褪黑素是典型的吲哚生物堿藥物。褪黑激素（Melatonin）主要是由哺乳動物和人類的松果體產生的一種胺類激素，化學名稱為N-乙酰基-5-甲氧基色胺。
　　N-乙酰基-5-甲氧基色胺
　　褪黑激素的生物合成：松果體在光神經的控制下，由色氨酸轉化成5-羥色氨酸，進一步轉化成5-羥色胺，在N-乙酰基轉移酶的作用下，再轉化成N-乙酰基-5-羥色胺，最后合成褪黑激素，從而使體內的含量呈晝夜性的節律改變。褪黑素每日分泌量極少，但在晝夜調節、性成熟、生殖、免疫反應、腫瘤、衰老過程中起著重要的作用。
　　褪黑素的抗腫瘤作用：Vijayalaxmi等（1995）體外研究發現，褪黑激素對137Cs的γ射線（150cGy）所造成的人體外周淋巴細胞染色體損傷有明顯的保護作用，且呈劑量—效應關系；對自由基產生的物理和化學致突變性和致癌性有拮抗作用。體外試驗表明，褪黑激素對自力霉素C引起的致突變性也有保護作用。褪黑激素能降低化學致癌物（黃樟素）誘發的DNA加成物的形成，防止DNA損傷。
　　（三）吲哚藥效團在酪氨酸激酶抑制劑中的應用
　　舒尼替尼是一種經典的酪氨酸激酶受體抑制劑，其母核中就含有吲哚結構的重要藥效團。
　　舒尼替尼
　　實驗證明，舒尼替尼能夠抑制80多種酪氨酸激酶和多種生長因子受體，如血小板源性生長因子受體（platelet derived growth factor receptors，PDGFR）、血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptors，VEGFR）﹑I-型集落刺激因子受體（colony stimulating factor receptor type 1，CSF-1）、干細胞因子受體（stem cell factor receptor，KIT）等。
　　在酪氨酸激酶的腫瘤表達體系中，舒尼替尼能夠抑制多種酪氨酸激酶的磷酸化過程。通過實驗性腫瘤模型證實，舒尼替尼有抑制腫瘤細胞生長、退化、轉移的作用。對于酪氨酸激酶調控失靈的腫瘤細胞，舒尼替尼能夠抑制其生長。
　　舒尼替尼的靶點，如VEGF、PDGFR、raf、HIF等很多在腎癌細胞中都是高表達的。Ⅱ和Ⅲ期臨床試驗表明，舒尼替尼可使腫瘤穩定，受益率為70%—75%，在相當多患者中延長PFS，控制力、反應率比干擾素治療顯著提高，生存率提高，一線治療有很好效果，二線治療效果也很好，有非常好的應用前景。
　　舒尼替尼與索拉非尼治療轉移性腎癌都有很好的療效，都是抑制血管生成和細胞增殖，靶位可能有所不同。
　　（四）酪氨酸激酶抑制劑——貝雷文尼
　　隨著分子生物學技術的發展和提高，和從細胞受體及增殖調控的分子水平對腫瘤發病機制的進一步了解和認識，人類開始了以關鍵基因、細胞受體和調控分子為靶點的治療方法的研究，稱其為“靶向治療”。貝雷文尼正是在這樣的趨勢下，研究和發展起來的新一代靶向抗癌藥物。
　　貝雷文尼
　　Brivanib alaninate
　　貝雷文尼一種分子靶向新藥，是由百時美施貴寶公司（BMS）開發的。它通過抑制血管生成和誘導細胞凋亡起到抗腫瘤作用。前期臨床研究表明貝雷文尼對肝細胞癌有較好的抗腫瘤效果。
　　貝雷文尼是一種選擇性血管內皮生長因子（VEGFR）酪氨酸激酶抑制劑，該酶通常表達于上皮來源的實體瘤。酪氨酸激酶抑制劑（TKI）為一類能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。酪氨酸激酶是一類催化ATP上γ-磷酸轉移到蛋白酪氨酸殘基上的激酶，能催化多種底物蛋白質酪氨酸殘基磷酸化，在細胞生長、增殖、分化中具有重要作用。迄今發現的蛋白酪氨酸激酶中多數屬于致癌RNA病毒的癌基因產物，也可由脊椎動物的原癌基因產生。
　　酪氨酸激酶抑制劑可作為三磷酸腺苷（ATP）與酪氨酸激酶結合的競爭性抑制劑，也可作為酪氨酸的類似物，阻斷酪氨酸激酶的活性，抑制細胞增殖，已經開發為數種抗腫瘤藥物。
　　貝雷文尼對索拉非尼和沙利度胺治療失敗的患者有效且耐受性良好。研究還發現血清Ⅳ型膠原下降與較長的PFS、OS相關，可能是貝雷文尼治療有效的一個生物標志物。
　　貝雷文尼與索拉非尼“頭對頭”比較一線治療晚期HCC和貝雷文尼對照安慰劑治療索拉非尼治療失敗或不能耐受的肝癌的兩項Ⅲ期國際研究剛開展。貝雷文尼有望成為肝癌分子靶向治療另一個可供選擇的藥物。
　　三、目標化合物設計
　　合成路線與條件：（1）乙酰乙酸乙酯，鈉氫，濃硫酸，室溫，12小時；（2）氯化芐，四氫呋喃，室溫，12小時；（3）鈀碳，氯化銨，四氫呋喃，甲醇，室溫，12小時。
　　路線一是本小組設計的第一條路線，因為其在實驗過程中收率較低，產物在反應環境中不穩定，故最后放棄。
　　舊路線從表面上看來比新路線步驟少而且操作簡單，但實驗證明在氫氣鈀碳環境下吲哚產物不穩定，最后一步關環反應產率很低，所以在綜合考慮已有文獻和前期實驗結果后，我們最終確定了一條四步的新反應路線（路線二）。
　　合成路線與條件：（1）乙酰乙酸乙酯，鈉氫，濃硫酸，室溫，12小時；（2）碳酸鉀，甲醇，回流，2小時；（3）吡啶鹽酸鹽，180度，5小時；（4）保險粉，室溫，19小時。
　　四、化學合成
　　（一）合成路線
　　合成路線與條件：（1）乙酰乙酸乙酯，鈉氫，濃硫酸，室溫，12小時；（2）碳酸鉀，甲醇，回流，2小時；（3）吡啶鹽酸鹽，180度，5小時；（4）保險粉，室溫，19小時。
　　（二）實驗討論
　　在反應步驟a中要注意原料加入的順序，應當先加入乙酰乙酸乙酯和氫化鈉拔氫，再加入原料三氟硝基苯。同時，在此步中要控制反應系統的溫度不能過高。
　　在反應步驟b中要注意加入碳酸鉀的作用是中和生成的HF，使反應不斷向右進行，使反應產率變高。同時要注意加熱的溫度，使甲醇充分回流。
　　在反應步驟c中要注意吡啶鹽酸鹽的脫甲基作用，可用軟硬酸堿理論解釋。同時注意此步的后處理過程較為困難繁瑣，可用優化萃取的方式，獲得較高的產率。
　　在反應步驟d中要注意加入保險粉時需分批加入，防止強還原性的低亞硫酸鈉和水大量放熱，此處可用用冰水浴控溫。
　　五、實驗操作
　　MS用HP1100LC/MSD質譜儀測定。薄層層析（TLC）板采用硅膠GF254（煙臺江民硅膠開發有限公司生產）與濃度為0.8%的CMC-Na蒸餾水溶液攪拌均勻后鋪板，經100-110℃活化一小時后放置于干燥器內保存備用，于紫外燈下（波長254nm）顯色；柱層析采用200-300目硅膠（煙臺江民硅膠開發有限公司生產），干法裝柱。試劑均為市售化學純或分析純產品，除特別說明外，不經處理直接使用。
　　（一）2-丙酮基-3，4-二氟硝基苯
　　2-acetone and 3，4-fluorine nitrobenzene
　　將鈉氫（10.1g）混溶（混懸）于四氫呋喃（480mL）中，加入2L的四頸瓶，室溫攪拌，隨后緩慢滴加乙酰乙酸乙酯（47g，0.36mol，至反應液，內溫上升至27℃后下降，此時置于冰水浴中降溫，溫度維持在22℃左右。溶液變為淡黃色澄清溶液。滴加三氟硝基苯（32g，0.18mol，約105滴/分鐘），撤去冰浴，恢復室溫，溶液呈現澄清酒紅色，內溫22℃，繼續攪拌3小時，內溫在20℃至22℃之間波動。反應結束后加氯化銨溶液調節pH值至4，溶液的紅色逐漸變淡直至消失。反應液用乙酸乙酯萃取三次，有機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得油狀物66.3g，隨后加入濃硫酸50mL和乙酸62mL，70℃下反應過夜。反應結束后，加水稀釋反應液，用乙酸乙酯萃取三次，有機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液濃縮得油狀物，快速硅膠柱層析得紅色油狀物Briva-1共27.2g，收率70.24%。
　　ESI-MSm/z:215［M+H］。
　　（二）2-丙酮基-3-氟-4-甲氧基硝基苯
　　2-acetone-3-fluorine-4-hydroxy nitrobenzene
　　將Briva-1（5g，23.24mmol），KCO（2.73g，19.75mmol）溶于甲醇溶液（3mL），加熱至70℃。回流速度大約40滴/分鐘，溶液深紅色。2小時后回流變慢，約10滴/分鐘，點板觀察發現未完全反應完，將外溫上調至73℃。共反應5小時，將反應液用乙酸乙酯水萃取，取乙酸乙酯層旋蒸，得棕黃色固體3.6g。收率72.67%。
　　mp:84.5℃
　　ESI-MS m/z：229［M+H］。
　　HNMR（CDCl，300MHz）：8.067（1H，m，HAr），6.988（1H，t，HAr），4.228（2H，d，CHAr），3.998（3H，s，CHOAr），2.371（3H，s，CH）
　　（三）2-丙酮基-3-氟-4-羥基硝基苯
　　2-acetone-3-fluorine-4-oxhydryl nitrobenzene
　　將Briva-2（3g，13.2mmol）和吡啶鹽酸鹽（6.1g，52.82mmol）放入三頸瓶中，180℃加熱，固體融化為黑色液體。5小時后，溶液用乙酸乙酯和水萃取，取乙酸乙酯層旋干得棕黑色固體1.81g。用洗脫劑（石油醚：乙酸乙酯=6:1）柱層析得黃色的純品1.50g，收率56.86%。
　　mp:167.1℃
　　ESI-MS m/z：213［M+H］。
　　HNMR（CDCl，300MHz）：7.988（1H，m，HAr），6.956（1H，t，HAr），6.494（1H，s，HOAr），4.212（2H，d，CHAr），2.408（3H，s，CH）
　　（四）2-甲基-4-氟-5-羥基-吲哚
　　2-methyl-4-fluorine-5-hydroxyl-indoles
　　取Briva-3（1.524g，7.15mmol）和水（33.48ml）加入50ml三頸瓶，黃色固體不溶，室溫攪拌。分配加入NaSO（保險粉6.9g，39.6mmol），溫度逐漸上升至36℃，冰浴降溫至17℃，溶液內有黃色絮狀物，20min內保險粉加完，溶液逐漸由黃色變為乳白色，內溫8℃。反應過夜（19h）。溶液最終呈乳黃色，乙酸乙酯和水萃取，最終得固體（1.054g）。產率89.25%。
　　mp:146.7℃
　　HNMR（CDCl，300MHz）：10.803（1H，s，-HN-），8.684（1H，s，HOAr），6.882（1H，d，HAr），6.661（1H，t，HAr），6.055（1H，s，—CH=），2.335（3H，s，CH）
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