胎盤干細胞在組織工程中的應用進展

[摘要] 作為一種新的種子細胞來源，本文論述了胎盤干細胞的臨床必要性，分離方法及生物學特性，探討了同種異體移植的免疫性及腫瘤原性，并總結了其在組織工程中的應用。

[關鍵詞] 胎盤干細胞，組織工程

[中圖分類號] R71 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2012）36-0009-03

自從美國科學家Langer R[1]在1993年提出組織工程概念以來，再生醫學的發展為臨床諸多慢性及器官衰竭疾病的治愈帶來了新的希望。研究者利用細胞移植替代病損組織，甚至整個器官。但是，為了獲得按需使用的商品化組織工程產品，主要取決于如何獲得維持構建器官所需的數目巨大的種子細胞。具有多向分化能力的干細胞在組織工程中得到了廣泛應用[2]。適宜的種子細胞應該滿足以下標準：細胞應該具有多向分化能力，簡單易得；細胞活力好，能夠大規模地獲得；免疫耐受；無致瘤性，能在體外培養傳較多代而不發生性狀改變。最近，胎盤來源的干細胞引起了越來越多的關注。

1使用胎盤干細胞的臨床必要性

與其他類型的細胞相比，干細胞具有獨特的性狀，它可向不同類型的成體細胞分化。按照來源的不同，干細胞可分為胚胎干細胞與成體干細胞。胚胎干細胞在合適的條件下可以向所有的成年組織分化，是擁有無限分化潛能的細胞。與其對應的是成體干細胞，一種廣泛存在組織器官內的多能分化細胞，它們擁有有限的分化潛能，多數可分化為它們“駐留”處的組織。有趣的是，盡管不同的成體干細胞都有多向分化潛能，但鑒別主要是靠它的組織來源。人的胚胎干細胞目前還不能精確控制其向某一組織分化，且多用于克隆動物等研究[3]，而成體干細胞則有較少的倫理問題及較安全的分化潛能。骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是目前使用較廣泛的成體干細胞，而且被認為是骨組織工程種子細胞的“金標準”[4]。但是，它在骨髓中的含量極少（約占有核細胞的1%），生長分化能力隨年齡的增長而顯著降低，因此需要尋找新的、標準的干細胞來源。不斷有新來源的、能滿足臨床不同需要的成體干/祖細胞被分離報道，如脂肪源干/祖細胞、外周血源干/祖細胞等，而最近報道的胎盤源性干細胞（placenta-derived mesenchymal stem cells，PMSCs）更是以其取材幾乎不受限制、數量多、能預先培養儲存等優勢而成為研究的重點。

胎盤是母體與胎兒間物質交換的器官，由羊膜、葉狀絨毛膜和底蛻膜構成。晚期囊胚著床后，滋養層細胞分裂增生，分為細胞滋養細胞與合體滋養細胞。胎盤由滋養細胞及間充質和血管共同組成，為免疫“豁免”組織，提示胎盤中可能存在干細胞成分[5]。目前的研究表明，PMSCs可從胎盤的實質組織中分離得到，并且PMSCs具有向其他組織細胞誘導分化的能力[6]。胎盤在孕婦分娩后即成為“醫療廢物”，因而從中獲取干細胞對受體無任何損傷，且胎盤來源廣泛，便于取材，對供者無不利影響，因此，PMSCs有望成為BMSCs的理想替代來源。正確分離PMSCs、鑒定其表型和功能、研究在疾病治療中的具體作用機制以及與其他免疫細胞之間的相互關系，對于深入認識PMSCs的特性、加速臨床應用具有非常重要的意義。

2 胎盤干細胞的生物學特性及分離方法

根據國際細胞治療學會的標準[7]，間充質干細胞至少要滿足以下3個條件：能貼壁生長；表達CD105， CD73和CD90等表面標志，不表達造血干細胞的表面標志；體外能向骨、軟骨、脂肪細胞分化。根據胎盤源性干細胞研討會達成的共識以及國際細胞治療協會關于多能間充質細胞的最低標準，明確了這些干/祖細胞的分離方法以及應滿足的條件[8]：①可黏附于塑料瓶壁。②形成纖維母細胞克隆。③表達特征性表面抗原，CD73、CD90、CD105表達率應>95%，而造血干細胞標志應陰性或表達率≤2%。④多向分化潛能，包括向骨、脂肪、軟骨、血管/內皮分化。⑤胎兒來源。Jaroscak等[9]首先報道了關于胎盤來源的干細胞，發現胎盤貼壁細胞與BMSCs表達基本相似的細胞表面標志，都具有多向分化潛能，但胎盤貼壁細胞的同質性不如BMSC。

PMSCs的提取多采用機械分離加酶消化法。BL Yen等[10]取足月產婦的胎盤組織，剪去底蛻膜、羊膜及臍帶，剪碎，在含有膠原酶的消化液中消化，收集離心的細胞，以完全培養基重懸后以1∶2的比例加到淋巴細胞分離液上離心后收集中間層細胞接種培養，通過換液去除不貼壁的細胞，通過挑取單細胞克隆培養進行純化。Fukuchi等[11]從（１１．４±２．１） g胎盤組織中能獲得平均（１０８±７８）×106個單個核細胞，當平均一個胎盤為（７２８±１４１） ｇ時，則平均一個胎盤可提供6.8×109個單個核細胞。Yuan W等[12]使用時間-密度離心的方法分離PMSCs，這種方法分離的細胞具有較低的免疫原性，能抑制PHA激活的異體淋巴細胞增殖，具備較好的異種移植潛力。苗宗寧等[13]取正常剖宮產之足月健康產婦的新鮮胎盤組織，按中央帶、中間帶、邊緣帶行免疫組化研究，得到的結論認為，胎盤的各處都有表達CD166、CD90、CD29的干細胞，臍帶附著處下方胎盤組織為干細胞富集區域。Kim MJ等[14]比較了PMSCs與臍帶干細胞的特性，認為臍帶干細胞可以刺激更多的礦物質的分泌，而PMSCs更易向脂肪細胞分化。臍帶干細胞高表達CYP3A4 mRNA，一種成熟肝細胞的表面標志。

Jaramillo-Ferrada PA等[15]經原位雜交證實，PMSCs主要為胎兒來源，通過流式細胞儀分析揭示胎盤來源的干細胞表達典型的間充質細胞特性（ＣＤ７３，ＣＤ９０，ＣＤ１０５，ＣＤ４４，ＣＤ１４６，ＣＤ１６６）與多向分化特征（Ｏｃｔ－４，Ｓｏｘ２，Ｎａｎｏｇ，Ｌｉｎ２８與 Ｋｌｆ４），而造血干細胞的標志CD34、CD45為陰性。進行誘導分化時，PMSCs顯示了較差的脂肪細胞分化，更強的向骨與軟骨細胞分化潛能。經過培養，90％～95％的細胞表現為同質性，但由于胎盤細胞成分復雜，挑取單個克隆分離培養可能是更好的方法。張毅等[16]首次從胎盤灌流液中培養出干細胞，PMSCs在形態上與BMSCs類似，傳代培養后可見細胞細長，同質性較好，生長迅速；體外多次擴增傳代見細胞形態無明顯改變。Timmins NE[17]等使用多孔微載體，在密閉的生物反應器內，使用一個胎盤可以制造出7000份治療劑量的干細胞。

與骨髓MSC一樣，在不同的誘導培養基中，PMSCs能向軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞分化，且可檢測到骨鈣蛋白、Ⅱ型膠原、脂肪等的表達。干細胞的分化可能與miRNA有關。miRNA是內源性表達的小的非編碼RNA，它們含有約20個核苷酸，控制轉錄后基因表達。miRNAs通過靶向mRNAs中的同源序列調控信使RNA表達，進一步調控內源性基因的表達。Guo等[18]發現，許多不同種類的miRNA通過調節旁路分化來控制細胞的分化。miR-335的高表達可使干細胞保持在“自持”狀態而不分化，低表達則可使干細胞增殖，分化及遷移。

3 胎盤干細胞的免疫學特性

作為一種可在體外預先建立的干細胞庫，實現即時使用的種子細胞，細胞的免疫排斥反應正在引起學者的關注。胎盤干細胞在免疫學上有兩個突出的特性：免疫抑制及所謂的“免疫特赦”。干細胞介導的免疫抑制是指干細胞可抑制T淋巴細胞，B淋巴細胞及NK細胞的部分免疫功能。作用機制包括抑制增殖，抑制可溶性細胞因子，抑制細胞毒性物質的分泌。“免疫特赦”意味著干細胞在某種程度上自身能躲過免疫防御機制的作用。免疫學表型分析表明，間充質干細胞具有抑制同種異體免疫反應、降低移植物抗宿主反應的作用[19]。干細胞的免疫調節作用機制復雜：干細胞具有較低免疫原性的特點，不表達 CD80、CD86和CD40等T淋巴細胞活化所需的共刺激分子。這些細胞僅表達MHC-I，雖然MHC-I可以激活異物反應T細胞，但是由于缺乏協同刺激因子，導致信號傳導受限，因此最終免疫細胞對PMSC無細胞免疫反應[20]。

Lee JM等[21]使用CD3與CD28單抗活化T細胞，再將其與PMSCs及BMSCs共同培養，證實兩種干細胞對淋巴細胞均有抑制作用，并且抑制程度與干細胞的數量呈正比。與BMSCs比較，PMSCs的HLA-ABC 與HLA-G的表達較高，IL-2、IL-4、IL-13的表達也較高。而H.Fazekasova1[22]比較了PMSCs與BMSCs，認為PMSCs的HLA-I表達較低，而PDL-1與CD1a的水平較高。使用IFN處理后，PMSCs下調了HLA-DR的表達，而BMSCs則持續低水平表達。即使不使用IFN處理，BMSCs也不會引起異體T細胞增殖；而即使使用IFN處理，高濃度的PMSCs也能引起少量的T細胞增值，說明BMSCs的免疫調節作用強于PMSCs，這可能與PMSCs的細胞成分復雜有關。

4 胎盤干細胞在組織工程中的應用

自從Friedenstein等首先描述了骨髓干細胞以來，自體BMSCs仍是目前應用最廣的種子細胞，且在許多領域被視為種子細胞的“金標準”。通過針刺抽取的侵入性操作存在供區疼痛，感染等風險。考慮到臨床需求的復雜性，許多疾病好發于老年人，而骨髓組織內的干細胞質量大大降低[23]，但關鍵是細胞不能預先培養儲存，難以即時使用；而PMSCs取材幾乎不受限制，能預先培養儲存，建立胎盤干細胞庫，真正合乎組織工程的要求[24]。

Park S等[25]分離PMSCs，將其注入帕金森小鼠的紋狀體內，在24周的觀察周期內可見小鼠的運動功能幾乎恢復正常。免疫組化及PET掃描可見分泌多巴胺的細胞生成，證實了注入的細胞在體內能向神經細胞分化。Ventura C等[26]發現透明質酸、丁酸和維甲酸組成的混合酯可促進人PMSCs向心/血管細胞分化。PMSCs移植物可增高梗死側心臟的毛細血管密度，正常化左室功能，減少瘢痕形成。這些改善可能與移植PMSCs后，通過局部或旁分泌促進血管生成，抗凋亡及促有絲分裂因子有關。Reddy S等[27]比較了不同來源的干細胞與支架材料的體內成骨能力。與臍帶來源的干細胞、胎兒骨髓來源的干細胞以及脂肪組織來源的干細胞比較，PMSCs顯示了最強的成骨能力。Bailey MM等[28]將顳下頜關節紊亂的顳下頜軟骨細胞，PMSCs分別與聚乳酸支架材料復合，在促軟骨細胞分化的誘導培養基中培養4周，發現前者僅分泌少量Ⅰ型膠原，而后者能大量分泌Ⅰ型膠原及部分Ⅱ型膠原，且后者的細胞活力較前者高約55%。如能較易獲取大量PMSCs，則在頜面外科與骨科替代治療中可獲得廣泛應用。

另外PMSCs的腫瘤原性也值得關注， 一方面干細胞通過轉化為腫瘤基質細胞促進腫瘤生長，另一方面干細胞的免疫抑制功能也是其促腫瘤效應的必要條件。Vikram S等[29]將PMSCs長期培養，未見細胞周期及凋亡特性的明顯改變，且不易形成侵襲性克隆。BMSCs與乳腺癌細胞共同培養時可轉化為腫瘤樣的成纖維細胞，Subramanian A等發現PMSCs與BMSCs分別在乳腺癌誘導液中培養1個月，PMSCs沒有任何變化，而BMSCs則變為了細薄的纖維細胞樣，增殖率增快，腫瘤相關標志如FSP、VEGF、EGF與Tn-C等明顯增多。實驗結果證實PMSCs不易轉變為腫瘤樣的成纖維細胞，不易促進實體腫瘤的增殖，從而可能成為一種更安全的細胞治療種子細胞。

綜上所述，在組織工程的研究與應用中，種子細胞的獲取、體外培養擴增、長期儲存等是制約其發展的重要問題之一。而PMSCs增殖、分化能力較強，有利于成為良好的種子細胞來源。如能建立一套理想的PMSCs獲取和培養方法，即有望在組織工程中獲得廣泛的利用。

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（收稿日期：2012-10-08）