siRNA治療原發性肝癌研究進展

關鍵詞 小干擾RNA 原發性肝癌

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.07.006

原發性肝細胞癌(PHCC)在世界范圍內居常見腫瘤的第五位。近年來，隨著分子生物學、免疫學、基因治療學的發展，小干擾RNA（siRNA）以其特有的生物學特性及潛在的生物醫學應用價值在PHCC治療研究中成為熱點。本文從siRNA的分子機制、原發性肝癌基因治療原理及siRNA治療肝癌的問題與展望幾個方面做一闡述。

siRNA的背景及機制

siRNA相關背景：RNA是生物體內最重要的物質基礎之一，它與DNA和蛋白質一起構成生命的框架。它可通過互補序列的結合反作用于DNA，從而關閉或調節基因的表達。甚至某些小分子RNA可以通過指導基因的開關來調控細胞的發育時鐘。

RNA干涉（RNAi）現象早在1993年就有報道，1995年，康奈爾大學的Su Guo博士用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發現，反義RNA(antisense RNA)和正義RNA(sense RNA)都阻斷了基因的表達，他們對這個結果百思不得其解。直到1998年，Andrew Fire的研究證明，在正義RNA阻斷了基因表達的試驗中，真正起作用的是雙鏈RNA。于是提出了RNAi這個詞。目前RNAi的作用機理主要是在線蟲、果蠅、斑馬魚等生物體內闡明的［1］。

siRNA發生的分子機制：siRNA發生詳細機制和過程目前還不完全清楚，大致分為以下幾個階段進行。①siRNA的形成階段：此階段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特異性的核酸內切酶Dicer等共同參與。Rde-1、4編碼的蛋白識別外源dsRNA，引導dsRNA與Dicer結合，然后，Dicer將dsRNA解旋，再將其裂解為21-25nt大小的siRNA。Dicer定位于胞漿中，但核內mRNA剪切修飾后在向核外運輸過程中也存在RNAi現象，可能有其他類似功能的酶發揮作用。現認為21-25nt大小并在3′端帶有2-3個堿基懸端且5′端磷酸化的siRNA誘導的RNAi效應最強。Dicer家族在進化上非常保守，有N-端RNA解旋酶結構域、1個PAZ結構域(PAZ)、2個RNase Ⅲ結構域和C端dsRNA結合基序5個組成部分［2］。②RNA誘導的沉默復合物(RISC)形成階段：生成的siRNA和RNAi特異性酶如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶結合形成RISC，具有序列特異性核酸內切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特異地降解與siRNA同源的靶mRNA。③效應階段：siRNA引導RISC與同源性的mRNA結合，在ATP及解旋酶(如qde-3、mut-6、mut-14)的作用下使siRNA鏈解離，并使RISC由250kD大小的前體形式變成約100kD左右活性形式，同時解旋酶催化同源mRNA與siRNA的正義鏈相互交換，核酸酶在mRNA與反義RNA所形成的雙鏈區的5′起始端下游7-10個核苷酸處切斷mRNA，起到特異的抑制基因表達的效果。④擴增階段：該反應以siRNA中的一條鏈為引物，以靶mRNA為摸板，在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下，擴增靶mRNA，產生新的二級siRNA，而這些siRNA又能繼續反作用于靶mRNA［3］。RdRP不僅能增加siRNA的拷貝數，而且能將異常的單鏈RNA轉變dsRNA。RdRP還是一個重要的“sensor”，它能識別正常和異常的RNA。轉基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的識別下啟動RNAi的反應過程［4］。

siRNA在肝癌基因治療中的作用

抑制癌基因表達：癌基因的過度激活和異常表達在導致細胞癌變中起重要作用。某些細胞基因被激活后異常表達，其產物為生長因子及其受體、蛋白激酶、信號轉導系統及核蛋白等。這些產物可引起細胞生長和分化異常，從而發生組織癌變。siRNA可以特異地封閉這些基因的轉錄產物，而不影響其他基因的表達，且在體內作用更加穩定、可靠、安全。myc基因核蛋白型癌基因轉錄因子參與了細胞分化和惡性增殖，具有促使DNA復制的功能，可在一些致癌因素作用下(如病毒、放射性和化學誘變劑)發生基因重排和擴增而得以活化［5］。近年來，人們把siRNA技術引入到c-myc功能的研究中，通過體外合成的c-myc siRNA抑制COS1細胞內的cmyc表達活性，成功地抑制了肝癌細胞的增殖。肝癌的發生發展與HBV和HCV密切相關，采用siRNA靶向治療HBV或HCV，對于預防肝癌的發生有重要意義。

抑制抑癌基因突變：抑癌基因突變或者表達凋亡抑制基因會導致細胞凋亡阻滯，從而引起細胞增生活躍，癌癥發生。使用siRNA封閉凋亡抑制基因的表達為腫瘤治療提供了一條新的途徑。野生型p53基因可以阻止細胞進入DNA合成期，誘導細胞發生凋亡。但p53突變后致瘤性明顯增強，且癌細胞具有高度侵襲性。Leirdal等［6］以p53為靶標設計合成siRNA，通過逆轉錄病毒為載體導入HepG2細胞株，發現細胞停滯于S期，生長受抑。

抑制細胞周期素的過度表達：腫瘤分子生物學研究顯示在腫瘤發生中通常有細胞周期調控因子的突變，提示在阻止腫瘤發生發展中維持細胞周期穩定性十分重要。Li等［7］將針對cyclin E基因編碼區設計siRNA轉染HCC細胞，結果顯示cyclin E的表達可被抑制達90%，該基因的沉默促進了HCC細胞的凋亡，阻斷了其增殖。

抑制過度表達的生長因子和受體：肝細胞生長因子(HGF)是一種很強的刺激肝細胞增殖的絲裂原。HGF的單一受體c-Met是一跨膜蛋白，由原癌基因c-met編碼。當細胞過度表達c-Met時，常常導致腫瘤細胞的侵襲、轉移。Xie等［8］通過逆轉錄病毒載體介導，成功建立了長期穩定表達c-met-siRNA的肝癌細胞株MHCC97-H/c-met-siRNA，將該細胞株種植于裸小鼠體內，發現腫瘤細胞的生長受到明顯抑制。

抑制凋亡抑制蛋白的過度表達：Survivin基因是迄今為止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成員，可通過抑制caspase級鏈反應下游的caspase 3、caspase 7發揮其抗凋亡作用［9］。通過靶向survivin小片段RNA干擾后，survivin蛋白在肝癌細胞中的表達降低，肝癌細胞凋亡增加，在體內外生長均受到抑制，對化療藥物的敏感性增加，提高了肝癌治療的整體療效。

抑制端粒酶：端粒酶的激活使癌細胞染色體端粒維持在一定長度，一方面使細胞獲得永生，另一方面使細胞周期縮短、生長變快。端粒酶中的催化亞基是決定端粒酶活性的關鍵因素，與惡性腫瘤的關系更為密切，其編碼基因統稱為hTERT。因此hTERT可作為腫瘤基因治療的靶點。hTERT RNAi不但對肝癌細胞的生物學特征有重要影響，而且通過腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)誘導，顯著提高腫瘤細胞的凋亡［10］。

增強機體對化療的耐受能力：HCC對化療藥物有高度的耐藥性，通過封閉化療抑抗基因，提高機體對化療藥物的敏感性，從而減輕化療對機體的損傷，提高腫瘤治療效果。多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細胞對化療藥物的原發性或繼發性抵抗性現象。MDR1是產生多藥耐藥的編碼基因之一，其過度表達是引起腫瘤細胞對化療藥物產生多重耐藥的原因。利用siRNA技術抑制MDR1基因表達，可使肝癌耐藥株對化療藥物敏感性增強［11］。

問題及展望

目前，siRNA的研究已從體外試驗過度到體內試驗，為肝癌的臨床治療奠定了基礎。siRNA作為即將應用于臨床的新技術仍然存在許多問題。①siRNA具有高度特異性，即使單個堿基錯配也會使RNAi效率降低；②并非所有的基因均可作為siRNA干擾的目標序列，非編碼區的RNA是否對RNAi敏感還有待研究；③如何將siRNA安全有效地導入細胞并在其內穩定表達尚需大量的試驗為臨床治療鋪平道路；④siRNA在動物試驗中能否特異地靶向癌組織中過度表達的蛋白基因，而不影響正常表達的同一基因；⑤由于腫瘤是多基因疾病，siRNA能否靶向多個基因而又不互相干擾；⑥siRNA對肝癌基因的封閉不完全的提高封閉率也是有待研究的。因此，siRNA技術應用于肝癌的臨床治療目前條件尚不成熟，仍需進一步研究。

參考文獻

1 Christian W.Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs［J］.NatureBiotechnology，2007，10:1238.

2 謝淑麗，朱明光.Rhoc在肝癌細胞生長中的作用及分子機制［J］.中華腫瘤雜志，2011，33(4):270.

3 R M.Small interfering RNAs and their chemical synthesis［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2002，41(13):2265.

4 D G.Small silencing RNAs:state-of-the-art［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(9):672.

5 王要軍，謝渭芬，張忠兵.小干擾RNA在肝病中的應用進展［J］.國際外科學雜志，2006，32(2):81.

6 Leirdal M，sioud M.Gene silencing in mammalian cells by preformed smalI RNA duplexes［J］.Biochem Biophy Res Commun，2002，295(19):744.

7 Li K，Lin SY，Brunicardi FC，et al.Use of RNA interference to target cyclin E overexpressing hepacellular carcinoma［J］.Cancer Res，2003，63(13):3593.

8 Xie B，Tang DG，Dong JH，et a1.Effeccts of c-met-siRNA on the growth and invasion 0f hepatocellular carcinoma MHCC97-H cells［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2006，14(7):499.

9 Altieri DC.Survivin and apoptosis control［J］.Adv Cancer Res，2003，88:31.

10 Zhang RG，Fang DC，Luo YH， et al.Effects of hTERT RNAi on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by TRAIL［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2006，14(6):435.

11 Chen XP， Wang Q， Guan J， et al. Reversing multiding resistance by RNA interference throuugh the suppression of MDRl gene in human hepatoma cells［J］.World J Gastroenterol，2006，12(21):3332.