慢性乙型肝炎患者外周血骨橋蛋白水平及其臨床意義

【摘要】 目的 檢測慢性乙肝患者的外周血骨橋蛋白（OPN）水平，研究OPN與慢性乙肝的關系其臨床意義。方法 采用酶聯免疫吸附試驗方法檢測8例健康對照者和47例慢性乙型肝炎患者的外周血骨橋蛋白水平，觀察其在各組中的表達水平并探討其在慢性乙肝疾病發展中的意義。結果 所有慢性肝炎組外周血OPN水平均高于正常組，OPN水平隨肝臟炎癥程度加重而增高，與反映肝臟炎癥的生化指標呈正相關，與乙肝病毒的復制無關。結論 測定骨橋蛋白水平變化可評估乙肝患者肝功能狀況及疾病的嚴重程度，對判斷乙肝患者預后有一定價值。

【關鍵詞】 骨橋蛋白；慢性乙肝；酶聯免疫吸附試驗

慢性乙肝是我國常見的慢性傳染病之一，同時也是一個全球性的公共衛生問題，全世界共約3.5億人感染乙肝病毒，且每年不斷有新發感染者，而感染HBV后一旦慢性化后，病情遷延不愈，經過若干年后最終發展至肝硬化甚至肝癌，嚴重危害全人類的健康。然而，慢性乙型肝炎的致病環節仍未完全闡明，但病毒持續復制和機體免疫清除反應是發病的主要因素。

骨橋蛋白（Osteopontin OPN）是一種帶負電的非膠原性骨基質糖蛋白，由多種組織細胞合成與分泌，廣泛的分布于多種組織和細胞中，功能上具有細胞因子的特點，在多種疾病的發生、發展中起著重要作用。研究發現骨橋蛋白是免疫細胞募集及啟動Th1細胞免疫的關鍵細胞因子，參與許多炎癥反應的病理過程，與多個系統疾病發病有關。本實驗通過檢測不同程度肝功損害的人外周血骨橋蛋白水平，探討其在慢性乙肝中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 55例患者取自廣東醫學院附屬醫院2009年4月-2010年1月間住院患者，其中單純慢性乙型肝炎且無肝硬化者35例（輕度16例，中度9例，重度10例），男性32例，女性3例，年齡范圍在17-70（平均年齡43.66±15.10）歲間，慢性重型乙型肝炎12例，男性10例，女性2例，年齡范圍在24-63（平均年齡47.83±14.27）歲間，正常對照組8例，男性5例，女性3例，年齡范圍在24-57（平均年齡36.63±10.50）歲間。慢性乙肝的診斷符合2005年中華醫學會肝病分會、感染病分會修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準，6個月內未接受過抗病毒治療，排除血清學檢測證實其他肝炎病毒感染或重疊感染者，排除非病毒感染如嗜酒、使用肝毒性藥物等引起的慢性肝炎或隱源性肝炎。

1.2 實驗方法

1.2.1 血樣 用清潔試管收集血液，抽血30分鐘后離心，1000×g15分鐘，收集血清，分裝后-20℃冷凍保存。

1.2.2 檢測外周血OPN 采用酶聯免疫吸附實驗法（ELISA）技術檢測。OPN試劑購自武漢博士德生物工程有限公司，使用美國寶特BIO-TEK ELX800型酶標儀檢測，各項操作均嚴格按照說明進行。

1.2.3 檢測各項生化指標 采用常規方法檢測血清轉氨酶、膽紅素、白蛋白、A/G比值、膽堿酯酶、凝血酶原時間等，PCR法檢測HBV-DNA載量。

1.3 統計學分析 計量資料均采用平均數±標準差表示，樣本均數間用t檢驗或方差分析，相關性分析用Pearson相關，檢驗水準α=0.05，實驗結果采用SPSS13.0統計軟件進行分析。

2 結 果

2.1 各組血清骨橋蛋白水平比較 各組肝炎均高于正常組，與正常組比較存在顯著差異。組與組間的兩兩比較均有統計學差異，見表1。

2.2 將肝炎患者按輕度、中度、重度、重型分組，分別與正常組的骨橋蛋白進行水平，除輕度組與正常組無統計學差異外，其余組均高于正常組且存在統計學意義。組與組比較均存在統計學差異，見表2。

2.3 肝炎患者外周血骨橋蛋白水平與肝功能各個指標之間的關系 骨橋蛋白與谷丙轉氨酶沒有相關性，與谷草轉氨酶、總膽紅素、凝血酶原時間呈正相關，與膽堿酯酶、白蛋白、A/G比值呈負相關，見表3。

2.4 慢性乙肝外周血OPN水平與乙型肝炎病毒（HBV-DNA）、HBeAg之間的關系 結果提示HBV-DNA、HBeAg復制變化分組之間不存在統計學差異，見表4。HBV-DNA復制水平分組之間也不存在統計學差異，見表5。

3 討 論

目前認為HBV感染人體后出現的一系列改變與人體的免疫狀態有關，主要是由細胞介導的免疫損傷引起的。乙型肝炎病毒感染及慢性化過程中有多種免疫細胞通過直接殺傷和分泌細胞因子抑制病毒，間接導致肝細胞的損害，產生炎癥反應。目前Th1/Th2細胞因子分泌失調和樹突狀細胞（DC）數量及功能低下是乙肝慢性化機制中報道比較多的。HBV感染后Th0細胞可在不同的信號刺激下分化成為Thl或Th2細胞。Thl細胞是促炎性T細胞，HBV感染后分泌細胞因子能增強NK細胞、巨噬細胞以及特異性的CTL等免疫細胞的活性，使免疫攻擊加強，清除病毒同時造成肝細胞損傷。HBsAg特異性的Th1細胞的缺陷導致HBV感染后中和性抗體的缺陷，使病毒不能被有效地清除，從而使HBV持續存在。Th2細胞則主要促進體液免疫，HBV感染后輔助B細胞分化為漿細胞，產生抗體，中和胞外病原體。研究表明HBcAg免疫后IL-10表達增強，而產生IFN-γ的CD4+T細胞數量很少。體內細胞因子IL-10的分泌增加可以拮抗Thl型細胞因子IL-2的分泌，導致機體對病毒的細胞免疫功能減弱，造成病毒的持續感染。劉駿[1]報道HBV感染患者體內Th1細胞的生物學功能及其細胞因子的產生均低下。慢性乙型肝炎病人外周血和肝臟中的單個核細胞（PBMC）產生IL-10的細胞比產生IFN-γ細胞明顯增多。這些均提示慢性乙肝以Th2應答為主。DC將抗原提呈給未受抗原刺激的Th0細胞，同時分泌細胞因子IL-12等，調節Th0分化成Th1或Th2細胞。慢性乙型肝炎患者體內DC功能明顯低下，不能將抗原的信號提呈給機體的免疫系統，造成患者體內缺乏有效的CTL應答，導致產生清除HBV效應失敗，從而使患者HBV持續感染。慢性乙型肝炎的急性發作推測是Th1/Th2平衡的打破，Th1占優勢，清除病毒的同時損傷肝細胞。邱慶明[2]研究證實慢性乙型肝炎急性發作時Th1細胞比例升高，與肝炎活動程度呈正相關。唐克誠[3]對慢性重型乙型肝炎患者不同時期的Th1/Th2細胞因子檢測，發現不同病情階段Th1與Th2反應細胞因子的表達水平不同，早期以IL-10分泌增多為主，晚期則以IFN-γ和IL-12水平大幅度提高為主。在肝炎活動期分別補充IL-l0及IL-12，肝臟炎癥及病毒清除向不同的方向發展，IL-12明顯增強慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞對HBeAg的應答和產生IFN-γ。體外實驗也證實，骨橋蛋白能促進及調節其它免疫細胞的細胞因子表達。在體外培養的小鼠巨噬細胞中加入OPN，48h后可檢測到高濃度的IL-12，而檢測不到IL-10；與OPN+/+小鼠相比，OPN-/-小鼠注入乙烯聚合吡咯烷酮（PVP）所誘導的IL-12表達低95%，IFN-γ低90%。這是因為，骨橋蛋白又稱為早期T淋巴細胞活化因子Ⅰ，具有促趨化作用，能引起巨噬細胞、T細胞和樹突狀細胞的遷移，在對抗感染的非特異性免疫及自身免疫中起一定作用。Higuchi Y[4]稱OPN能促進CD4+T細胞的分化增殖，對CD8+T細胞能影響其遷移。Renkl等[5]證明OPN可以促進人的DCs激活、遷移，并誘導DCs的人白細胞DR抗原、粘附分子表達，并且增強其共刺激能力。在混合淋巴反應中，OPN促進DCs分泌IL-12、TNF-α，并且誘導DCs向利于原始T細胞Th1極化的方向成熟。

早期是在四氯化碳引起的急性肝炎模型中發現骨橋蛋白表達增高。Sahai A等[6]對非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的骨橋蛋白測定，發現該小鼠骨橋蛋白水平和mRNA水平均增高。這些均提示在炎癥性肝病中骨橋蛋白表達增高，且與炎癥的嚴重程度有關。既往骨橋蛋白與肝炎的關系的研究主要來自中毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎等。對于慢性乙型肝炎與骨橋蛋白的關系的單獨研究則比較少。本實驗檢測了47例肝炎患者患者外周血骨橋蛋白水平，結果示總體慢性乙型肝炎組和慢性重型乙型肝炎組與正常組比較均高于正常組，且存在統計學意義。進一步分為慢性輕度、中度、重度、重型乙型肝炎，結果示除輕度肝炎組骨橋蛋白水平稍低于正常組水平且沒有統計學差異外，其余組與正常組比較均高于正常組且存在統計學差異，而且組與組間比較同樣存在統計學意義，骨橋蛋白水平隨著肝炎嚴重程度增加呈增高趨勢，尤其慢性重型乙型肝炎組增高顯著。與文獻報道一致。Matsui A[7]證實暴發型肝炎患者的骨橋蛋白水平明顯高于急、慢性肝炎及健康人，II期肝性腦病及病程10天內出現典型肝壞死者，骨橋蛋白水平升高更明顯。Arai M等[8]對暴發性肝衰竭和自限性肝炎患者血漿骨橋蛋白水平測定，發現前者明顯高于后者，均支持本研究結果。本實驗并對反映肝炎活動的多個指標與骨橋蛋白水平的關系進行了進一步研究，證實骨橋蛋白與谷草轉氨酶、膽紅素、白蛋白、凝血酶原時間、膽堿酯酶等部分反映肝臟功能的指標關系密切，肝臟炎癥分度越重，骨橋蛋白隨上述指標損害加重有增高趨勢，與谷丙轉氨酶、乙肝病毒載量無關。潘留蘭[9]等對乙型肝炎肝硬化患者外周血骨橋蛋白水平測定并分析提示慢性乙肝病毒感染性慢性肝臟疾病發生發展與細胞因子骨橋蛋白水平變化相關，支持該實驗結果。綜合上述資料認為骨橋蛋白與肝炎的關系主要通過各種免疫細胞和細胞因子來起作用，尤其在重型肝炎中水平明顯增高，同時有報道[10]應用骨橋蛋白的小干擾RNA（siRNA）可以減少刀豆蛋白A（Con-A）處理的小鼠肝壞死，那么在臨床中也許可以通過監測骨橋蛋白水平的變化來判斷慢性乙肝向重型肝炎發展的傾向。

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