E6AP與P53在宮頸癌組織中的表達及意義

【摘要】 目的 主要研究E6AP與P53在宮頸癌中的表達及其意義。方法 對45例宮頸癌、10例CIN及10例正常宮頸組織標本采用免疫組化法檢測P53蛋白，RT-PCR技術檢測E6AP基因的表達。結果 宮頸癌和CIN組織中P53蛋白表達的陽性率明顯高于正常宮頸，差異有統(tǒng)計學意義。E6AP基因在宮頸癌組織中表達高于CIN及正常宮頸組織，E6AP的表達水平隨臨床分期的進展而升高。P53陽性宮頸癌組織中的表達明顯高于陰性組織中的E6APmRNA表達，差異有統(tǒng)計學意義。結論 E6AP的表達與P53的表達關系密切，參與了宮頸上皮組織癌變的發(fā)生，并且在宮頸癌的發(fā)展中起重要作用。

【關鍵詞】 ：細胞內(nèi)的E6相關蛋白；p53蛋白；宮頸癌

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，是引起女性癌癥相關性死亡的重要原因。本文應用免疫組化方法檢測宮頸癌中P53的表達，RT-PCR技術檢測E6AP基因的表達，進而分析它們在宮頸癌變及發(fā)生、發(fā)展中的關系。

1 材料和方法

1.1 標本來源和處理 選取2010年6月至2012年6月大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科手術切除和活檢的宮頸癌患者標本45例，CIN患者10例、正常宮頸組織10例，患者取標本前均未接受放、化療及免疫治療。其中鱗癌41例，腺癌4例；按組織學分級：高分化19例，中分化19例，低分化7例；臨床分期按FIGO2009年標準：Ⅰ期25例，Ⅱ期16例，Ⅲ期4例。36例行手術治療，術后證實淋巴結轉(zhuǎn)移8例，未轉(zhuǎn)移28例。將所取標本組織分為兩塊，一塊10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片；另一塊經(jīng)液氮速凍后，儲存于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 免疫組化檢測P53蛋白表達 按照免疫組化方法SP二步法進行，采用PBS液代替一抗作為陰性對照。結果判定標準：P53蛋白以胞漿、細胞核和核周緣出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，根據(jù)染色強度及陽性細胞數(shù)量將陽性表達分為3級：①陽性細胞數(shù)5%-10%為弱陽性（+）；②陽性細胞數(shù)11%-50%為中度陽性（++）；③陽性細胞數(shù)>50%為強陽性（+++）。陽性細胞數(shù)<5%為陰性（-）。

1.3 RT-PCR技術檢測E6APmRNA的表達 目的基因在Pubmed中得到序列號，通過Primer Premier 5.0軟件設計E6AP及內(nèi)參β-actin的引物。然后使用Taq酶試劑盒及引物進行PCR反應。以E6AP/β-actin光密度比值作為E6APmRNA的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，采用計數(shù)資料采用Χ2檢驗，計量資料采用t檢驗。

2 結 果

2.1 P53蛋白的表達 45例宮頸癌組織中，P53陽性表達21例，陽性表達率為46.7%，其中鱗癌有19例（46.3%）、腺癌2例（50%）。比較不同宮頸癌組織學類型中P53蛋白表達，無顯著差異（P>0.05）。P53蛋白在10例CIN組織中5例陽性，陽性率50%。10例正常宮頸組織中1例陽性（10%）。P53蛋白在宮頸癌組織與CIN組織中陽性表達相比較無明顯差異（P>0.05）。但宮頸癌、CIN與正常宮頸組織相比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 E6APmRNA的表達 45例宮頸癌組織中，19例E6AP基因有表達，10例CIN組織中3例有表達，10例正常組織中2例有表達，表達率分別為42.2%、30.0%和20.0%。統(tǒng)計學分析表明，宮頸癌組的E6APmRNA表達量高于正常組和CIN組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。由此可知E6AP基因在正常和CIN組織中均有表達，但在癌性組織明顯增加。比較P53蛋白不同表達的組織中E6APmRNA的表達，P53陽性宮頸癌組織中的表達（0.0957±0.0623）明顯高于陰性組織中的E6APmRNA表達（0.0072±0.0093），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 E6AP基因的表達與腫瘤的關系 根據(jù)腫瘤不同的臨床病理特征研究發(fā)現(xiàn)，臨床分期Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ期之間比較，Ⅲ期E6AP的表達水平明顯升高，具有顯著差異性（P<0.05）。而宮頸癌E6AP基因的表達在組織學分型、組織學分級、淋巴結轉(zhuǎn)移各組間均無差異。

3 討 論

P53基因是細胞內(nèi)重要的腫瘤抑制基因和凋亡調(diào)節(jié)基因。當P53突變時，可導致腫瘤的發(fā)生。有研究表明P53蛋白過表達與宮頸癌的發(fā)生，及分化程度關系密切[1]，在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。宮頸癌中p53蛋白功能失活主要是通過HPVE6，利用E6AP泛素依賴途徑降解的，同時也抑制P53介導的細胞凋亡[2]。本研究通過免疫組化及RT-PCR技術探討E6AP表達與P53的關系及其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的意義。研究表明，E6AP的表達與P53的表達關系密切，參與了宮頸上皮組織癌變的發(fā)生，并且在宮頸癌的發(fā)展中起重要作用。目前關于E6AP基因與宮頸癌的關系的研究大多處于對基礎的研究階段。本實驗從mRNA水平研究了E6AP在不同宮頸組織的表達與臨床病理特征的關系，我們的研究認為E6AP參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，E6AP選擇性抑制劑可能會成為預防宮頸癌的一種新策略。

參考文獻

[1] 郎爽，孔繁斗，呂申，等.hMLH1、P27、P53 的表達及其在宮頸癌發(fā)病中的意義[J].中國微生態(tài)學雜志，2006，18（6）：451- 453.

[2] Zanier K，Charbonnier S，Baltzinger M，et al.Kinetic analysis of the interactions of human PaPillomavirus E6 oncoProteins with the ubiquitin ligase E6AP using surface Plasmon resonance[J].J Mol Biol，2005，349（2）：401-413.