高效液相色譜法測(cè)定卡介菌多糖核酸中苯酚殘留量

【摘要】 目的 采用高效液相色譜法測(cè)定卡介菌多糖核酸注射液中苯酚的殘留量。方法 色譜柱C18ODS柱（250×4.6mm，5μm）。流動(dòng)相：水-甲醇（50：50V/V），流速為1ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，柱溫為25℃；進(jìn)樣量：10μl。結(jié)果 在5μg/ml-25μg/ml間，苯酚峰面積與濃度的線性方程為Y=9.2766X-0.3115（r=0.9994），線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為0.04μg/ml，且卡介菌多糖核酸中苯酚能得到良好分離，重現(xiàn)性好。結(jié)論 本方法快速簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，且無污染。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜；苯酚；卡介菌多糖核酸

卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）是采用熱酚法去除蛋白質(zhì)，研制成的新一代卡介菌提取物，臨床上廣泛用于預(yù)防和治療感冒、哮喘、慢性氣管炎、病毒感染性疾病、自身免疫性疾病[1]。

該疫苗在制備過程中，使用有機(jī)溶劑苯酚。苯酚是最簡(jiǎn)單的酚，為無色固體，有特殊氣味，呈酸性，早期用氣相色譜法或溴化容量法可分別測(cè)定各種酚類，由于操作過程繁瑣，應(yīng)用受到一定限制。本文根據(jù)《中國(guó)藥典》三部（2010版）對(duì)生物制品的質(zhì)量控制要求[2]，采用高效液相色譜法測(cè)定卡介菌多糖核酸中苯酚殘留量[3]，該方法靈敏度高、精密性好。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 卡介菌多糖核酸注射液、苯酚、無水乙醇、甲醇。

1.2 主要儀器 高效液相色譜儀、電子天平、超聲儀。

1.3 溶液制備

1.3.1 對(duì)照品溶液 取苯酚適量，精密稱定。置200ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋定容，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液適量，加乙醇稀釋為0-20μg/ml濃度的線性對(duì)照溶液。

1.3.2 供試品溶液 精密取卡介菌多糖核酸注射液0.5ml，置2ml離心管中，加乙醇1ml，超聲5分鐘，16000rpm離心5分鐘，精密量取上清液作為供試品溶液。

1.4 色譜條件 色譜柱C18ODS柱（250×4.6mm，5μm）。流動(dòng)相：水-甲醇（50：50V/V），流速為1ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm，柱溫為25℃；進(jìn)樣量：10μl。

1.5 方法的線性關(guān)系考察 取苯酚約10mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取儲(chǔ)備液適量，加乙醇分別稀釋成5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄色譜圖。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)μg/ml，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.6 檢測(cè)限確定 取苯酚對(duì)照品溶液，加乙醇分別稀釋成5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml系列的供試品溶液，注入高效液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)試分析，確定可檢測(cè)出的最低水平作為檢測(cè)限。

1.7 精密度試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)的確定 取苯酚對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，通過檢驗(yàn)數(shù)據(jù)表明方法的重復(fù)性能達(dá)到試驗(yàn)的要求。

1.8 卡介菌多糖核酸注射液進(jìn)行苯酚殘留量檢查 按照經(jīng)驗(yàn)證的苯酚殘留量檢測(cè)方法，對(duì)三批卡介菌多糖核酸注射液的苯酚殘留量進(jìn)行測(cè)定，批號(hào)：K20101001、K20101002、K20101003，取注射液0.5ml置2ml離心管中，加乙醇定容至1ml，超聲5分鐘，16000rpm離心5分鐘，精密量取上清液作為供試溶液。精密量取供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀，將苯酚色譜峰峰面積代入線性方程，計(jì)算卡介菌多糖核酸注射液中苯酚的殘留量。

2 結(jié) 果

2.1 方法線性關(guān)系 通過試驗(yàn)表明，對(duì)照品在5μg/ml-25μg/ml濃度之間，苯酚濃度與峰面積有很好的線性關(guān)系。

2.2 方法檢測(cè)限 通過對(duì)苯酚不同濃度的檢查，最低檢測(cè)限值為0.04μg/ml，見表1。

2.3 方法的精密性 苯酚保留時(shí)間為6.571min，保留時(shí)間的RSD為0.48%；峰面積為，峰面積的RSD為1.43%，均小于2%，表明該方法重復(fù)性及重現(xiàn)性良好，見表2。

2.4 樣品測(cè)定 證明卡介菌多糖核酸注射液中苯酚殘留量符合要求，見表3。

3 討 論

采用無水乙醇提取，高效液相色譜法對(duì)卡介菌多糖核酸注射液中苯酚殘留量的測(cè)定研究。該方法線性關(guān)系好、靈敏度高、重現(xiàn)性好（峰面積的RSD均小于2%），為卡介菌多糖核酸中苯酚殘留量的測(cè)定建立了一種靈敏、簡(jiǎn)單方便、應(yīng)用范圍廣的方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 黨昶永，樊寶平，殷書平.卡提素臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25（7）：657-658.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（三部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄16-19.

[3] 阮國(guó)洪.水中苯酚、苯二酚和苯三酚的高效液相色譜分析方法的研究[J].環(huán)境與健康雜志，2002，19（1）：64-65.