游離脂肪酸及葡萄糖對鼠主動脈內皮細胞的影響及作用機制

[摘要] 目的 探討高糖高游離脂肪酸（free fatty acids，FFAs）對內皮細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制。 方法 原代培養大鼠主動脈內皮細胞（rat aorta endothelial cell，RAEC），采用不同濃度的葡萄糖（5.5 mmol/L，30 mmol/L）及棕櫚酸（200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L）單獨或聯合作用于細胞24 h、48 h、72 h。免疫組織化學染色方法鑒定內皮細胞并測定IL-8、Bcl-2、BAX表達水平；MTT比色法檢測細胞增殖率。 結果 FFAs及葡萄糖單獨及聯合應用均可導致細胞出現凋亡形態學變化，增殖呈劑量-時間依賴性（P ＜ 0.05），且聯合組明顯低于單獨培養組（P ＜ 0.01）；干預后IL-8、BAX表達增加，Bcl-2蛋白表達逐漸減弱，Bcl-2/BAX比值逐漸減小，聯合培養組表達更為明顯。 結論 高濃度FFAs及高糖具有抑制內皮細胞生長、促進其凋亡的作用，其作用機制可能是通過葡萄糖及棕櫚酸酯參與PI3K/AKT等途徑激活氧化應激誘導細胞凋亡。

[關鍵詞] 糖尿??；游離脂肪酸；內皮細胞；bcl-2；BAX；PI3K/AKT

[中圖分類號] R34[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）10-0004-04

Influence and mechanism of free fatty acid and glucose on endothelial cell of rat aorta

GUO Hailian1 LIU Xiaoling2 LI Pengcui3 HAN Le2 WANG Dongqing1

1.Graduate School of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China; 2.Department of Endocrinology， the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001，China； 3.Department of Orthopaedic Laboratory， the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China

[Abstract] Objective To explore the influence and mechanism of free fatty acid（FFAs） and glucose on endothelial cell proliferation and apoptosis. Methods Rat aorta endothelial cell （RAEC）were cultured in vitro， glucose(5.5 mmol/L， 30 mmol/L) and palmitic acid (200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L) in different concentration were applied，alone and together， to RAEC for 24 h， 48 h， 72 h. Immunohistochemistry were used to determine CD31-related antigen and detectedIL-8， Bcl-2， BAX protein expression changes; Applied four methyl azo thiazole blue (determined by MTT) colorimetric detection different environment RAEC proliferation capacity. Results Glucose and FFAs， alone and together， can lead to apoptotic morphological changes in RAEC； FFAs and glucose display strong growth inhibitory effect in a-time and does-development manner against RAEC (P < 0.05)， and the combination group was significantly lower than the proliferation of cultured alone group (P < 0.01). After intervention， IL-8， BAX expression were increased， Bcl-2 protein expression were gradually decreased， Bcl-2/BAX ratio wrere decreased， and more obvirous expression of the combination group. Conclusion High FFAs and high glucose can inhibit the growth of RAEC and promote their apoptosis， its mechanism may be involved by glucose and palmitate PI3K/AKT pathway activation oxidative stress-induced apoptosis.

[Key words] Diabetes mellit; Free fatty acid; Endothelial cell; bcl-2; BAX; PI3K/AKT

糖尿病血管病變是糖尿病的主要并發癥之一，也是糖尿病患者致殘和致死的主要并發癥，其中血管內皮細胞的損傷在血管并發癥中起著關鍵作用[1]。2001年美國糖尿病學會年會上，BANTING科學獎得主McGarry JD 教授提出，脂代謝障礙是2型糖尿病及其并發癥的基本病理生理改變[2]。伴隨著葡萄糖利用和代謝障礙，脂肪的合成代謝障礙而分解代謝異常增高，血液中FFAs含量增多，而FFAs在一定程度上可反映2型糖尿病患者體內脂代謝異常狀況。FFAs尤其是棕櫚酸（palmitic acid，PA）可導致內皮細胞功能障礙，是糖尿病血管病變的關鍵因素。因此，探討脂毒性對糖尿病血管病變的影響及可能的機制對臨床具有一定的指導意義。本實驗觀察高糖狀態下不同濃度的棕櫚酸對大鼠主動脈內皮細胞的影響，并探討其可能的作用機制，為糖尿病血管病變的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

SD大鼠（山西醫科大學實驗動物中心），軟脂酸（Gibco，USA），RPMI 1640（武漢博士德），胎牛血清（Cyagen Biosciences，USA），大鼠內皮細胞生長因子（VEGF）（Prospec，USA），胰蛋白酶（TRYPSIN 1：250）（Solarbio），去脂牛血清白蛋白（d-BSA）、四甲基偶氮唑藍（MTT）（sigma，USA），即用型兔抗大鼠CD31單克隆一抗試劑盒（武漢博士德）、即用型兔抗大鼠bcl-2單克隆一抗試劑盒（武漢博士德）、即用型兔抗大鼠BAX單克隆一抗試劑盒（武漢博士德）、即用型SABC免疫組織化學染色試劑盒（武漢博士德），DAB顯色液（武漢博士德）。

1.2 主動脈內皮細胞的培養與鑒定

頸椎脫臼處死SD雌性大鼠，碘伏酒精消毒后，逐層剖開胸腹腔，于脊柱旁暴露主動脈，游離主動脈周圍筋膜及結締組織，分離后取主動脈弓至髂總動脈段，剪下放入無菌PBS液中漂洗去除附壁血細胞后，放入1640培養液中，使用眼科鑷將主動脈內膜翻轉朝外，并剪成1～2 mm寬動脈環，平均擺放入25 cm2培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養箱中靜置1 h后，加入配制好的大鼠專用內皮細胞培養液（RPMI1640、20%胎牛血清、大鼠內皮生長因子、肝素、青鏈霉素），靜置68 h以上。每3天更換培養液一次，待細胞生長單層融合后，0.25%胰酶消化傳代，實驗使用3～5代細胞。采用形態學、倒置顯微鏡及抗CD31抗體免疫組化染色法行內皮細胞鑒定。

1.3 實驗分組

試驗共設置7組：（1）游離脂肪酸干預組設3組：以去脂牛血清白蛋白（d-BSA）為溶解軟脂酸的載體，以加入培養液中軟脂酸濃度的不同分為200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L（各組載體d-BSA含量為0.2%、0.4%、0.6%）；（2）葡萄糖干預組，30 mmol/L GLU；（3）聯合培養組：30 mmol/L GLU + 400 μmol/L PA；（4）對照組：①正常培養液組（含5.5mmol/L GLU），②0.5% d-BSA+正常培養液組。

1.4 形態學觀察

以每孔1×104個細胞接種于6孔板中，細胞貼壁后加入PA及葡萄糖。設正常培養液組和0.5%d-BSA+正常培養液組為對照，于5%CO2、37℃溫箱中孵育48 h，在倒置顯微鏡下觀察并照相。

1.5 生長曲線的測定

取90%單層融合的鼠主動脈內皮細胞P3代細胞消化成單細胞懸液，調整細胞濃度為3×104/mL，接種至24孔培養板中，每孔1 mL，每三孔為1組，共8組。每隔24 h抽查一組，用血球計數板數細胞數目，以時間為橫坐標，培養細胞數對數為縱坐標繪制生長曲線。細胞倍增時間以以下公式計算：TD =T×log2/（log Nt-log No），T為培養時間，Nt和No分別代表接種后及培養T小時后的細胞數。

1.6 主動脈內皮細胞生存率的檢測（MTT比色法）

將細胞培養至單層融合時，換無血清RPMI1640培養液同步化細胞24 h，分別給于不同濃度的干預液，共同孵育24 h、48 h、72 h終點時，每孔依次加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），避光繼續培養4 h，棄培養上清液；每孔加入DMSO 150 μL，置37℃水浴搖床均勻震蕩10 min，室溫放置10 min，使結晶物充分溶解；用酶標儀在492 nm波長處測定其吸光度（A）值。

1.7 免疫化學染色法測定IL-8、Bcl-2/BAX表達水平

常規消化，收集主動脈內皮細胞，按照每孔1×105接種于放有蓋玻片的6孔板內，每孔加入2 mL 1640內皮細胞培養液，置于37℃、5%CO2孵育箱細胞爬片24 h，換無血清培養液培養24 h同步化細胞后加入不同濃度的棕櫚酸及葡萄糖繼續培養48 h，在48 h終點進行試驗：先用PBS洗兩次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗兩次，滅活酶室溫30 min，蒸餾水洗2次，胰酶37℃修復10 min，PBS洗2次，山羊血清37℃封閉30 min，按操作說明滴加抗體，蘇木素復染，脫水透明風干后封片，每次試驗均以PBS代替一抗作為陰性對照組，以胞質出現棕黃色顆粒為陽性。采用Image-Pro Plus（IPP）分析免疫組化圖片。

1.8 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件，實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較顯著性檢驗采用方差分析（ANOVA），兩兩比較用q檢驗，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 主動脈內皮細胞形態

原代細胞在培養5～7 d后，在主動脈貼壁附近可見少量游出的內皮細胞，呈多角形或短梭形；培養到12～13 d，可見遷移出的細胞呈片生長，70%～80%單層融合，分布密度不均。見圖1。大鼠主動脈內皮細胞在傳代接種2 h后開始貼壁，24 h后90%細胞貼壁生長，24～48 h間細胞量有所減少，48 h后可見新長出的細胞為單層、互不重疊，呈梭形或鵝卵石狀，邊界清晰，胞漿豐富，核清晰，呈多角形。第3～5天，可見細胞呈小片狀集落生長，細胞漲勢增快，第5～7天細胞生長融合成片，中間排列緊密，部分可見典型的“鋪路石”狀排列的單層細胞。培養至7～8代后，細胞變瘦小，分泌物增多，可見細胞分化，成老化狀態。

圖1 原代大鼠主動脈內皮細胞100×

2.2 CD31相關抗原免疫組化鑒定結果

可見細胞呈圓形、梭形或多邊形，細胞胞漿內可見棕黃色顆粒（圖2a），而對照組內未見著色（圖2b）。證實培養的細胞為大鼠主動脈內皮細胞。

2.3 各組細胞（MTT）增殖狀況

不同劑量的棕櫚酸、葡萄糖及聯合培養組處理內皮細胞24 h、48 h、72 h后，與正常培養液組及d-BSA對照組相比差異有統計學意義（P ＜ 0.05），其中24 h低劑量PA組與對照組相比，差異無統計學意義（P ＞ 0.05），說明短時間低濃度的棕櫚酸酯對內皮細胞的損害較小；相同濃度時，24 h與72 h組內比較，高糖組、高、中、低劑量棕櫚酸組差異有高度統計學意義（P ＜ 0.01），聯合培養組不同時間段差異均有高度統計學意義（P ＜ 0.01）；高糖組、中、高劑量棕櫚酸組48 h與72 h組內比較，24 h與48 h組內比較差異有統計學意義（P ＜ 0.05），低劑量組24 h與48 h，48 h與72 h組內比較差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。正常培養液組與d-BSA組相比無統計學意義（P ＞ 0.05），見表1。說明棕櫚酸及高糖抑制大鼠主動脈內皮細胞增殖，并具有時間-劑量依賴趨勢；高糖及高脂聯合培養組具有協同抑制作用，且具有時間依賴趨勢。見圖3。

注：橫坐標（X軸）代表分組：①1640組為正常對照組（含GLU5.5 mmol/L）；②d-BSA組為0.5%d-BSA+1640對照組（含GLU5.5 mmol/L）；③高糖組為30 mmol/L GLU組；④聯合組為30 mmol/L GLU+400 μmol/L PA；⑤低濃度PA為200 μmol/LPA組；⑥中濃度PA為400 μmol/L PA組；⑦高濃度PA為600 μmol/L PA組；縱坐標（Y軸）代表增殖率

圖3 FFAs及葡萄糖對RAEC增殖的影響

2.4 細胞生長曲線

大鼠主動脈內皮細胞在傳代接種2 h后開始貼壁，24 h后90%細胞貼壁生長，24～48 h間細胞量有所減少，48 h后可見新長出的細胞為單層、互不重疊，傳代細胞增殖速率較原代細胞增長稍快，第4～7天為對數生長期，第8～9天為平臺期。細胞生長曲線呈“S”型。見圖4。

圖4 大鼠主動脈內皮細胞生長曲線

2.5 細胞免疫組化法檢測結果

正常對照組、d-BSA對照組培養內皮細胞48 h后，IL-8、BAX幾乎不表達或弱表達，兩個對照組之間差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。不同濃度FFAs、高糖及聯合培養組處理細胞后，細胞IL-8表達明顯增高，且具有劑量-時間依賴關系，與對照組相比，差異均具有統計學意義（P ＜ 0.05）；細胞Bcl-2表達隨時間延長及濃度的增高表達逐漸減弱，與正常對照組及d-BSA對照組相比，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）；而細胞BAX表達則隨時間的延長及濃度的增加表達亦增強，與正常對照組及d-BSA組比較，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。Bcl-2/BAX比值隨葡萄糖及棕櫚酸濃度增高逐漸減低，聯合培養組為甚。見表2。

3 討論

糖尿病血管病變是糖尿病特異的病理生理改變，是糖尿病多種并發癥的共同病理生理基礎（糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變、糖尿病心血管病變）。2型糖尿病患者常伴有血脂代謝異常，血清游離脂肪酸濃度隨著血糖的增高而發生改變，伴隨空腹血糖水平的升高而升高[3]。血管內皮細胞裱襯在整個心血管系統的內表面，是血管壁與血液之間的分界細胞，是形成心血管封閉管道系統的形態基礎。血管內皮細胞不僅是炎癥反應的中介物，也是受損靶器官，通過一系列復雜的機制從而影響炎癥反應的進展和結局。內皮細胞的存活和細胞的程序性死亡在維護血管結構及血管生成中是極其重要的[4]。

bcl-2基因（即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一種原癌基因，具有抑制凋亡的作用。bax基因屬于bcl-2基因家族，編碼的BAX蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產生阻抑作用。bax與bcl-2相互制約，在正常情況下二者保持一種平衡狀態。研究發現Bax/Bcl-2兩蛋白之間的比例關系是決定對細胞凋亡抑制作用強弱的關鍵因素，因此認為，bax是極重要的促細胞凋亡基因之一。BAX主要位于細胞質中，當凋亡發生時，BAX即刻轉移到線粒體并與線粒體膜相結合，通過加速線粒體內細胞色素C的釋放和增加Caspases的活性來促進細胞凋亡。目前國內外大多數學者把細胞Bcl-2/BAX值作為判斷細胞凋亡是否被抑制或加強的主要標志之一[5]。

高血糖能通過減少Akt活性抑制葡萄糖轉運子4（GLUT-4）介導葡萄糖轉運，導致2型糖尿病。高葡萄糖可明顯引起內皮細胞的早期凋亡，而不影響細胞的壞死，其形成可能與Akt酶活性下降有關。可能是通過PI3K-Akt信號途徑抑制內皮細胞增殖，Akt的308位點蘇氨酸磷酸化是葡萄糖影響內皮細胞增殖信號級聯中的敏感元件[6]。PI3K-Akt信號途徑在葡萄糖對內皮細胞增殖和凋亡過程中起了重要的作用[7]。因此，嚴格控制血糖是有效防治糖尿病血管并發癥的措施。

IL-8由多種細胞產生，包括外周血淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞等，近來發現內皮細胞及腎小管上皮細胞也可產生。IL-8參與多種炎癥疾患的發病過程，其自分泌和旁分泌功能已被證實在血管新生、腫瘤生長和轉移中起重要作用[8，9]。Tashiro等發現，糖尿病患者尿中IL-8水平與HbA1c水平有顯著聯系，提示高血糖可能刺激IL-8的合成和分泌[10]。我們的實驗證實，在高糖條件下，與對照組相比，IL-8表達增加，與Tashiro所觀察到的反應一致；而在FFAs干預下，實驗組中呈陽性表達，在正常對照組細胞內呈陰性表達，由此推測，在FFAs的誘導下，IL-8的上調，進一步介導炎性反應，在聯合組中，高糖及高脂具有協同作用，參與了糖尿病血管病變的發展和惡化。

本實驗研究證實大鼠主動脈內皮細胞在葡萄糖及FFAs干預下，細胞凋亡增加，并具有濃度-劑量依賴趨勢。在高糖環境下，FFAs引起Akt快速激活，并導致PI3K受體激活，增加了細胞內活性氧水平，通過氧化應激使細胞內IL-8表達增加，同時激活PKC通路，使其轉位，引起其下游Bcl-2蛋白表達減弱，BAX表達增強，因此，Bcl-2/BAX比值減小。FFAs誘導內皮細胞凋亡可能部分通過bcl-2改變線粒體膜的功能，并釋放細胞色素C，部分通過調整Bcl-2/BAX的比率引起細胞凋亡。因此，Bcl-2可抑制線粒體介導的細胞死亡[11]。高糖環境下，高棕櫚酸酯可激活細胞凋亡的機制導致內皮細胞凋亡，PI3K-Akt信號缺陷參與了糖尿病血管病變的發生發展，從而引起2型糖尿病患者心血管并發癥。

本研究結果顯示，糖尿病患者血漿中升高的FFAs通過影響內皮細胞的功能，損傷內皮細胞的完整性，從而在糖尿病血管病變中扮演一個非常重要的角色。FFAs引起的脂毒性在糖尿病血管病變中有重要的發病學意義，深入研究其發病機制及其作用機制，對預防及延緩糖尿病血管病變的發生發展具有廣闊的前景和重要的臨床價值。

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（收稿日期：2012-01-16）