靛玉紅對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

摘要目的：探討靛玉紅甲肟(IRO)對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法：MTT法檢測(cè)不同濃度、不同作用時(shí)間IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖活性的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞周期的影響。Western法檢測(cè)IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞CDK4和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果：MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，且表現(xiàn)為劑量依賴(lài)性(P＜0.01)。流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以10μmol/L的IRO處理Hep-2細(xì)胞后，細(xì)胞阻滯于G0/G1期，不同濃度組間差異存在顯著性(P＜0.01)。Western結(jié)果發(fā)現(xiàn)IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞CDK4和cyclin D蛋白的表達(dá)有抑制作用(P＜0.01)。結(jié)論：IRO具有抑制人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制與阻滯細(xì)胞于G0/G1期有關(guān)。

關(guān)鍵詞 喉癌 靛玉紅甲肟 Hep-2 細(xì)胞周期 CDK4cyclinD1

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.09.235

靛玉紅是傳統(tǒng)中成藥當(dāng)歸中主要有效成分，在傳統(tǒng)的中醫(yī)多用于治療慢性粒細(xì)胞性白血病等慢性疾病，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明靛玉紅及其衍生物對(duì)對(duì)人類(lèi)多種腫瘤細(xì)胞均有顯著抑制作用［1］，但罕見(jiàn)其對(duì)人喉癌Hep-2系作用的報(bào)道。本文旨在研究靛玉紅衍生物靛玉紅甲肟(IRO)對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，并檢測(cè)其對(duì)周期相關(guān)基因CDK4和cyclin D蛋白表達(dá)的影響，探討IRO抗腫瘤的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料：人喉癌Hep-2細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物有限公司。RPMI-1640購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。靛玉紅甲肟(Indirubin-3’-monoxime，IRO)、UA和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和Trizol等試劑購(gòu)自Sigma公司；β-actin，CDK4和cyclin D抗體均購(gòu)自Santa Cruz。

方法：①細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理：Hep-2細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中(青霉素和鏈霉素各100u/ml)，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。IRO溶于DMSO配制成18mmol/L的母液，過(guò)濾除菌后-20℃?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)過(guò)程中DMSO終濃度不超過(guò)0.5%。②增殖抑制實(shí)驗(yàn)：Hep-2細(xì)胞消化收集后計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度按100μl/孔細(xì)胞懸液(1×105個(gè)細(xì)胞/ml)接種于96孔板，加入IRO終濃度為5、10、20μmol/L的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和空白對(duì)照(調(diào)零孔)各6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48小時(shí)。終止培養(yǎng)前4小時(shí)每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)，小心吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 150μl后與振蕩器上震蕩10分鐘，置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于570nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值(A值)，按下面方式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組A值-給藥組A值)/對(duì)照組A值×100%。③流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞：Hep-2細(xì)胞貼壁后加入IRO終濃度為5、10、20μmol/L的RPMI-1640完全培養(yǎng)基作用48小時(shí)，各組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶適度消化細(xì)胞，輕輕吹打制備單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液移入新的1.5ml離心管中，4℃，500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘。小心移去上清液后用冰預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，每管細(xì)胞收集數(shù)不少于106個(gè)細(xì)胞。上流式細(xì)胞儀雙染檢測(cè)凋亡進(jìn)行參數(shù)獲取和資料分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。④Western蛋白印跡法檢測(cè)IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞CDK4和cyclin D蛋白表達(dá)的影響：在6孔板上培養(yǎng)細(xì)胞至間接近融合，加入IRO終濃度為5、10、20μmol/L的RPMI-1640完全培養(yǎng)基作用24小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白。總蛋白濃度經(jīng)Bio-Rad測(cè)定后在SDS-PAGE凝膠中經(jīng)電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加稀釋一抗抗體(靶蛋白抗體)靜置過(guò)夜。經(jīng)TBST漂洗后加入二抗孵育后熒光顯色，沖洗并觀察結(jié)果，掃描蛋白印跡膠片后按照靶蛋白/β-actin蛋白比例用Scion圖像分析系統(tǒng)(4.02版本)分析條帶影像。每組試驗(yàn)重復(fù)3遍。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)均用X±S表示，采用SAS6.12和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。MTT結(jié)果采用雙因素方差分析，流式細(xì)胞儀和western結(jié)果采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

結(jié)果

IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖的影響：IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)性；不同濃度組間細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異均有顯著性(F=10.85，P＜0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖能力的影響

IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞周期的影響：經(jīng)5、10、20μmol/L的IRO作用24小時(shí)后Hep-2細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，分別增加至53.87±2.49、61.83±1.8、69.52±3.01，與對(duì)照組的46.98±2.11比較，不同時(shí)間組間差異有顯著性(F=49.758，P＜0.01)；S期細(xì)胞比例明顯增加，分別降低至35.15±4.53、26.21±3.56、19.87±5.72，與對(duì)照組的39.88±2.1比較，不同時(shí)間組間差異有顯著性(F=13.868，P＜0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2 IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞周期的影響(a：control，b：5μmol/L，c：10μmol/L，d：20μmol/L)

IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞CDK4和cyclin D蛋白表達(dá)的影響：經(jīng)5、10、20μmol/L的IRO作用24小時(shí)后Hep-2細(xì)胞CDK4蛋白表達(dá)明顯降低，分別降低至0.64±0.09、0.42±0.08、0.25±0.1，與對(duì)照組的0.81±0.09比較，不同時(shí)間組間差異有顯著性(F=23.874，P＜0.01)；Hep-2細(xì)胞CDK4蛋白表達(dá)明顯降低，分別降低至0.91±0.08、0.61±0.07、0.3±0.09，與對(duì)照組的1.08±0.09比較，不同時(shí)間組間差異有顯著性(F=50.044，P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 IRO作用24小時(shí)后Hep-2細(xì)胞CDK4和cyclin D蛋白的表達(dá)變化(M：marker；5μmol/L；10μmol/L；20μmol/L)

討論

頭頸部的鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)被認(rèn)為是世界第六大常見(jiàn)癌癥。喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)占頭頸部腫瘤的大部分。近年來(lái)研究表明喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率在中國(guó)呈逐漸上升趨勢(shì)。上述數(shù)據(jù)表明，喉癌已經(jīng)成為損害人類(lèi)生活中最重要的癌癥之一。近年來(lái)，隨著喉癌手術(shù)、放射治療等綜合治療方法的不斷改進(jìn)，使得喉癌患者的5年生存率及功能恢復(fù)率大為提高。然而由于喉癌生長(zhǎng)部位的特殊性加上手術(shù)和放射治療存在并發(fā)癥多、不良反應(yīng)大的問(wèn)題從而給患者帶來(lái)較大的痛苦。因此，急需要在化療方面提出新的、簡(jiǎn)便、有效、不良反應(yīng)小的治療藥物。靛玉紅是一種二聚吲哚類(lèi)化合物，自上世紀(jì)發(fā)現(xiàn)其對(duì)CML有明顯抑制作用以來(lái)，很多研究都發(fā)現(xiàn)靛玉紅具有巨大的抗腫瘤潛力。Yoon應(yīng)用5'-Nitro-indirubinoxime作用于唾液腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞SGT系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可以明顯抑制SGT細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［2］。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)靛玉紅可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制與抑制CDKs、GSK-3和Stat 3功能密切相關(guān)［3］。本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示隨藥物濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，IRO對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐步增加，呈明顯的濃度和時(shí)間依賴(lài)性。

細(xì)胞生長(zhǎng)周期與細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，在正常細(xì)胞受損時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，從而給細(xì)胞自身一定時(shí)間完成修復(fù)，必要時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明在多種腫瘤組織中都有細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的異常表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞周期的進(jìn)行，抑制DNA損傷的修復(fù)和凋亡的進(jìn)程，從而促使腫瘤細(xì)胞的異常增殖［4］。因而修正細(xì)胞周期的進(jìn)行已成為眾多化療藥物的主要作用機(jī)制之一［5~6］。為此，我們觀察了IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示隨著IRO濃度的增加G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，提示IRO可阻滯Hep-2細(xì)胞于G0/G1期而抑制Hep-2細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞周期調(diào)控模式是指細(xì)胞周期在不同時(shí)相的多個(gè)調(diào)控點(diǎn)上受到調(diào)節(jié)。其中最為重要3個(gè)調(diào)控點(diǎn)是G1/S，G2/M和有絲分裂中期/后期的交界處，腫瘤的發(fā)生多是這些調(diào)控點(diǎn)上的異常失控。研究表明有三類(lèi)細(xì)胞周期調(diào)控因子參與細(xì)胞周期的調(diào)控，它們分別是周期蛋白(cyclin)，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK)和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制物((CKI)，這3種因子之間的相互作用共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞周期的進(jìn)程。cyclin D1 and cdk4在腫瘤細(xì)胞和周?chē)h(huán)境中都發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)其抑制時(shí)細(xì)胞發(fā)展受到了抑制［7］。針對(duì)CDK4和cyclin D蛋白異常表達(dá)更正的實(shí)驗(yàn)也越來(lái)越受到人們的重視［8~9］。由于本次試驗(yàn)結(jié)果顯示IRO可阻滯Hep-2細(xì)胞于G0/G1期，因而我們觀察了IRO對(duì)Hep-2細(xì)胞CDK4和cyclin D蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，經(jīng)IRO作用后，Hep-2細(xì)胞CDK4和cyclin D蛋白表達(dá)下降，結(jié)果提示IRO的抗腫瘤作用可能與抑制CDK4和cyclin D蛋白表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞周期有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，IRO在體外對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞有明顯增殖抑制作用，其作用呈現(xiàn)出時(shí)間與劑量依賴(lài)性。其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)，但其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

1 Shi J，Shen HM.Critical role of Bid and Bax in indirubin-3'-monoxime-induced apoptosis in human cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，75(9):1729-42.

2 Yoon JH，Kim SA，Kim JI，et al.Inhibition of invasion and migration of salivary gland adenocarcinoma cells by 5'-nitro-indirubinoxime(5'-NIO)［J］.Head Neck，2010，32(5):619-25.

3 Chebel A，Kagialis-Girard S，Catallo R，et al.Indirubin derivatives inhibit m alignant lymphoid cell proliferation［J］.Leuk Lymphoma，2009，50(12):2049-60.

4 Chan CH，Lee SW，Wang J，et al.Regulation of Skp2 expression and activity and its role in cancer progression［J］.Scientific World Journal，2010，1(10):1001-15.

5 Sarita Rajender P，Ramasree D，Bhargavi K，et al.Selective inhibition of proteins regulating CDK/cyclin complexes:strategy against cancer--a review［J］.Curr Pharm Des，2011，17(3):256-71.

6 W?sierska-G?dek J，Maurer M.Promotion of apoptosis in cancer cells by selective purine-derived pharmacological CDK inhibitors: one outcome，many mechanisms［J］.J Recept Signal Transduct Res，2010，30(4):206-13.

7 Ciznadija D，Liu Y，Pyonteck SM，et al.Cyclin D1 and cdk4 mediate development of neurologically destructive oligodendroglioma［Ｊ］.Cancer Res，2011，71(19):6174-83.

8 Musgrove EA，Caldon CE，Barraclough J，et al.Cyclin D as a therapeutic target in cancer［Ｊ］.Nat Rev Cancer，2011，11(8):558-72.

9 Shimura T，Kakuda S，Ochiai Y，et al.Targeting the AKT/GSK3β/cyclin D1/Cdk4 survival signaling pathway for eradication of tumor radioresistance acquired by fractionated radiotherapy［Ｊ］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2011，80:150.