大孔吸附樹脂純化葛根總黃酮和總皂苷的研究

[摘要]目的 篩選同時純化葛根總黃酮和總皂苷的最佳吸附樹脂，系統研究影響大孔吸附樹脂吸附分離的多種因素，為葛根及其復方新藥研發及工業化生產提供參考。方法 以葛根總黃酮和總皂苷含量為考察指標，通過測定大孔吸附樹脂的吸附和解析能力及吸附動力學曲線、吸附等溫線、漏出曲線的繪制，優選葛根總黃酮和總皂苷的最佳純化工藝條件。 結果 D101型大孔吸附樹脂純化效果較好，其最佳工藝條件為取適當濃度的葛根提取液，上樣吸附速度為2 BV/h，飽和吸附后（總黃酮的飽和吸附量為54.93 mg/g），先以4 BV水洗脫，再分別以4 BV 30%、50%及70%乙醇解析。所得產物總黃酮和總皂苷含量分別為58.89%、26.32%。結論 方法簡便可行，純化效果好，能為葛根復方新藥研發及工業化生產提供參考。

[關鍵詞] 葛根總黃酮；葛根總皂苷；大孔吸附樹脂；吸附動力學曲線；吸附等溫線；漏出曲線

[中圖分類號] R284 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）04-47-04

葛根為《中國藥典》現行版收載品種，具解肌退熱，生津透疹，升陽止瀉之功。主治外感發熱、頭痛、項背強痛，口渴，消渴，麻疹不透，熱痢等；高血壓頸項強痛[1]。葛根主要含有異黃酮類、三萜類及皂苷類、查爾酮衍生物類及香豆素類等成分。具有多種藥理活性的異黃酮類是其主要有效成分[2]。迄今已從葛屬植物中分離的異黃酮成分主要有：葛根素（puerarin）、大豆苷元（daidzein）、大豆苷（daidzin）、3’-羥基葛根素（3’-hydroxy-puerarin）、染料木素（genistein）、染料木苷（genistin）、3’-甲氧基葛根素（3’-methoxy-puerarin）、葛根素-7-芹糖苷（puerarin-7-O-apioside）、芒柄花苷（formononetin-7-O-glucoside）、葛根素-7-葡萄糖苷（puerarin-7-O-glucoside）和大豆苷元-4’ 7-二葡萄糖苷（daidzein-4’ 7-diglucoside）等。三萜類及皂苷類是葛根中

另一類重要的化學成分。葛根中三萜類成分主要為齊墩果烷型，主要有大豆皂苷元A，B（soyasapogenol A，B）、葛根皂草精醇A，B，C（kudzusapogenol A，B，C）。葛根皂苷大部分是以這些苷元形成的，主要有葛根皂草苷A1-A5、SA1-SA3、C1（kudzusaponin A1-A5、SA1-SA3、C1）等。大孔吸附樹脂分離純化法越來越受藥物研究人員的青睞。文獻報道用于分離純化葛根總黃酮的方法有大孔吸附樹脂法[3-6] 和亞臨界水提取法[7]，分離純化葛根總皂苷的方法有大孔吸附樹脂法[8]。作者未檢索到同時分離純化葛根總黃酮及總皂苷的文獻。本研究旨在優選一種適合同時純化葛根黃酮和皂苷的大孔吸附樹脂，并研究其純化工藝條件。

1 儀器與試藥

紫外-可見分光光度計（Shimadzu，1240），Sartorius電子分析天平（德國產，d=0.01mg），DKZ-1型電熱恒溫振蕩水槽（上海精密實驗設備有限公司）。高氯酸、香草醛、乙醇等為分析純，水為純化水。葛根素及黃芪甲苷對照品購自中國食品藥品檢定研究院，均為含測用，批號分別為110752-200511及110781-200613。葛根藥材購自廣州市老百姓大藥房有限公司，經廣州中醫藥大學高英教授鑒定，為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根。大孔吸附樹脂購自相關經銷公司。

2 方法及結果

2.1 試驗溶液制備

2.1.1 對照品溶液 取葛根素及黃芪甲苷對照品適量，分別置10 mL量瓶中，加乙醇制成對照品儲備液。臨用時取適量加水稀釋成適宜濃度，搖勻，過濾，即得。

2.1.2 供試品溶液 取葛根飲片，加乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，濾過，回收乙醇，制成每1毫升含0.1 g藥材的溶液。

2.2 光譜條件選擇

2.2.1 總黃酮測定波長選擇 取葛根素對照品和供試品溶液，在200～400 nm掃描，結果見圖1。

試驗可知，葛根素對照品和供試品溶液的最大吸收均在250 nm波長處，故確定在250 nm波長處測定黃酮含量[9]。

2.2.2 總皂苷測定波長選擇 取黃芪甲苷對照品和供試品溶液各0.1 mL，揮干溶劑，用香草醛-高氯酸系統顯色，在400～600 nm掃描，結果見圖2。

由試驗結果可知，可選擇在540 nm測定總皂苷含量 [10]。

2.3 線性關系

2.3.1 總黃酮線性關系考察 取葛根素對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，分別置100mL量瓶中，各加水稀釋至刻度，搖勻，以乙醇0.1 mL加水稀釋100倍的溶液為空白，照紫外-可見分光光度法（中國藥典2010年版附錄VA），在250 nm波長處測定吸光度，以吸光度對濃度繪制標準

曲線，計算回歸方程：A=0.068 1C-0.006 8，γ=0.999 9，在1.645～13.16 μg/mL范圍內，葛根素濃度與吸光度的線性關系較好。

2.3.2 總皂苷線性關系考察 見文獻[11]方法及結果。

2.4 大孔吸附樹脂初步篩選

有多種大孔吸附樹脂可用于黃酮和皂苷的純化分離。從吸附及解吸性能對市售的九種大孔吸附樹脂進行對比研究。按照文獻[8]及[11]方法操作，計算比吸附量、吸附率及解吸率。結果見表1、圖3。

由試驗可知，D101、XDA-5、LX-18對葛根黃酮和皂苷的吸附率和解析率均較理想。故進一步考察這三種型號的樹脂。

2.5 繪制吸附動力學曲線

適合的吸附樹脂，應當具有吸附量高、吸附速度快、洗脫容易、得到的洗脫物總黃酮和總皂苷含量高、抗污染、使用壽命長等特點。參考文獻[8，11，12]方法繪制吸附動力學曲線。結果見圖4。

試驗結果表明，D101型大孔吸附樹脂對葛根總黃酮及總皂苷的吸附量和吸附速率以及達到吸附平衡所需時間均優于XDA-5和LX-18。故對D101型大孔吸附樹脂作吸附等溫線考察。

2.6 吸附等溫線考察

參考文獻 [8，11，12]方法操作，計算比吸附量。以比吸附量為縱坐標，吸附液濃度為橫坐標，繪制D101型大孔吸附樹脂的吸附等溫線。結果見圖5。

試驗表明，上樣溶液濃度與吸附量呈正相關，說明適當濃縮提取液，上樣液濃度的提高能提高樹脂利用率。

2.7 優化純化工藝條件

2.7.1 吸附速率 樹脂對被分離物質的吸附速率影響分離純化效果，擬比較3種上樣速度優選最適宜上樣吸附速度。參考文獻 [8，11，12]方法操作。結果見表2。

試驗結果表明，吸附速率為3 BV/h時總黃酮和總皂苷的損失均較大，說明吸附不完全，而吸附速率為1 BV/h或2 BV/h時吸附吸附效果較好，從生產實際考慮選擇1～2 BV/h上樣吸附。

2.7.2 繪制總黃酮漏出曲線 取供試品溶液，以2 BV/h持續通過D101型大孔吸附樹脂柱（1 BV =50 mL），每1BV收集1份漏出液，按照“2.3.1”項下方法，測定漏出液中總黃酮含量，以吸附液柱體積為橫坐標，漏出液含量為縱坐標，繪制漏出曲線。結果見圖6。

試驗表明，9 BV有黃酮類成分泄漏，至20 BV時吸附基本飽和。測定漏出液及4 BV水洗脫液中總黃酮，得D101型大孔吸附樹脂對葛根總黃酮的飽和吸附量為54.93 mg/g。

2.7.3 解析條件優選

2.7.3.1 用水量 參考文獻 [8，11]方法操作，洗脫用水量以4BV為宜。

2.7.3.2 解析劑濃度及用量 上述已水洗脫的樹脂柱，分別以4BV 30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇解析，按照“2.3.1”項下方法操作，計算解吸率。結果見圖7。

試驗表明，總黃酮解析率達96%以上，總皂苷解析率達70%，三種濃度乙醇梯度解析效果較好。

以上所得解析液合并，減壓回收乙醇，干燥，干膏得率為0.84%，測定其總黃酮和總皂苷含量分別為58.89%、26.32%。

3 結論

以葛根總黃酮和總皂苷含量為考察指標，通過測定九種大孔吸附樹脂的吸附和解析能力，初步篩選出適宜的三種樹脂XDA-5、D101、LX-18，繪制以上三種樹脂的吸附動力學曲線，比較吸附量和吸附速率以及達到吸附平衡所需時間，可知D101樹脂為較適合的樹脂，測定D101樹脂的吸附等溫線及漏出曲線。優選的同時純化總黃酮和總皂苷工藝條件：取適當濃度葛根提取液，以1～2BV/h速度上D101型大孔吸附樹脂柱吸附，先以4 BV水洗脫，棄去水洗脫液，再分別以4 BV的30%、50%及70%乙醇梯度解析。

由于葛根總皂苷含量測定時樣品前處理時須揮干待測溶劑，操作繁瑣費時，本實驗暫未繪制D101型大孔樹脂吸附葛根總皂苷時的漏出曲線。

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（收稿日期：2012-12-14）